蛋白盐析实验步骤及注意事项

蛋白盐析实验步骤及注意事项

一、实验步骤：

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

表1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）

饱和硫酸铵法：

1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

2.4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

3.置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。

4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

二、注意事项：

1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。

2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。

3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。

4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。

5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。

6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的盐析与透析 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液。 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。 附：胶棉半透膜的制备 市售5%的胶棉液，加入干燥的150mL锥形瓶中，将锥形瓶横斜不断转动，使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。倒出多余的胶棉液，然后倒置约1min使乙醚、乙醇不断蒸发，直到干燥。逐步剥离瓶口的薄膜，沿瓶壁薄膜夹缝注入蒸馏水，使薄膜逐步跟瓶壁胶离，轻轻取出，浸入蒸馏水中备用。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

实验室安全防护知识注意事项(正式)

编订：__________________ 单位：__________________ 时间：__________________ 实验室安全防护知识注意 事项(正式) Standardize The Management Mechanism To Make The Personnel In The Organization Operate According To The Established Standards And Reach The Expected Level. Word格式 / 完整 / 可编辑

文件编号：KG-AO-4600-41 实验室安全防护知识注意事项(正 式) 使用备注：本文档可用在日常工作场景，通过对管理机制、管理原则、管理方法以及管 理机构进行设置固定的规范，从而使得组织内人员按照既定标准、规范的要求进行操作，使日常工作或活动达到预期的水平。下载后就可自由编辑。 近日，合肥工业大学化学楼发生硫化氢泄漏事件。化学试剂在实验中随时充满了危险，因此需要特别注意！发点实验室安全防护方面的知识，一起学习。 化学实验中会经常使用各种化学药品和仪器设备，以及水、电、煤气，还会经常遇到高温、低温、高压、真空、高电压、高频和带有辐射源的实验条件和仪器。若缺乏必要的安全防护知识，会造成生命和财产的巨大损失。因此，对从事化学实验室工作人员的安全防护教育是非常重要的，必须引起本中心全体人员的重视。 危险化学品 易燃试剂 在处理易燃试剂时，都应严格检查在附近有无明

火。下列常用的有机溶剂都具有很大的易燃性：碳氢化合物如己烷、轻石油（即石油醚）、苯、甲苯；醇类如甲醇、乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；醚类化合物因其暴露在空气或见光会产生易爆炸的过氧化物，因此，使用时要特别注意。常用的乙醚和四氢呋喃就属于醚类，处理时要特别小心。 此外，乙醚还具有相当低的沸点和一定程度的麻醉作用，二硫化碳具有很高的易燃性，甚至用水浴加热都会导致它着火，因此在实验中应尽量避免使用。 氧化剂 硫酸、硝酸既有很强的腐蚀性，也有很强的氧化性。像漂白粉、过氧化氢、过酸、二氧化钴和高锰酸钾等都是很强的氧化剂。 腐蚀性药品 处理或使用腐蚀性试剂时一定要戴上防护手套。一旦溅到皮肤上，应立即用大量的水冲洗干净。无机酸当中的硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和硝酸，有机酸中的羧酸、磺酸都是具有腐蚀性的。苯酚也是相当危

蛋白提取步骤

提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。

BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。

实验室安全防护知识注意事项

实验室安全防护知识注意事项 姓名：XXX 部门：XXX 日期：XXX

实验室安全防护知识注意事项 近日，合肥工业大学化学楼发生硫化氢泄漏事件。化学试剂在实验中随时充满了危险，因此需要特别注意！发点实验室安全防护方面的知识，一起学习。 化学实验中会经常使用各种化学药品和仪器设备，以及水、电、煤气，还会经常遇到高温、低温、高压、真空、高电压、高频和带有辐射源的实验条件和仪器。若缺乏必要的安全防护知识，会造成生命和财产的巨大损失。因此，对从事化学实验室工作人员的安全防护教育是非常重要的，必须引起本中心全体人员的重视。 危险化学品 易燃试剂 在处理易燃试剂时，都应严格检查在附近有无明火。下列常用的有机溶剂都具有很大的易燃性： 碳氢化合物如己烷、轻石油（即石油醚）、苯、甲苯；醇类如甲醇、乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；醚类化合物因其暴露在空气或见光会产生易爆炸的过氧化物，因此，使用时要特别注意。常用的乙醚和四氢呋喃就属于醚类，处理时要特别小心。 此外，乙醚还具有相当低的沸点和一定程度的麻醉作用，二硫化碳具有很高的易燃性，甚至用水浴加热都会导致它着火，因此在实验中应尽量避免使用。 氧化剂 硫酸、硝酸既有很强的腐蚀性，也有很强的氧化性。像漂白粉、过氧化氢、过酸、二氧化钴和高锰酸钾等都是很强的氧化剂。 第 2 页共 5 页

腐蚀性药品 处理或使用腐蚀性试剂时一定要戴上防护手套。一旦溅到皮肤上，应立即用大量的水冲洗干净。无机酸当中的硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和硝酸，有机酸中的羧酸、磺酸都是具有腐蚀性的。苯酚也是相当危险的，能导致皮肤灼伤，它的有毒蒸气能够被皮肤吸收。无机碱中的氢氧化钠、氢氧化钾这样的强碱，硫酸钠、硫酸钾这样的弱碱都具有腐蚀性，有机碱中的胺、羟胺、三乙胺、吡啶等都具有腐蚀性。 液溴是非常危险的药品，它能导致皮肤、眼睛的灼伤，因此一定要在通风橱里使用。此外，由于它的密度较大，当用滴管转移时，即使不挤乳胶头，都可能因其重力而滴下来，因此，使用时要特别小心。 氯化亚砜、酰氯、无水三氯化铝以及其他的一些试剂，因能与水反应放出氯化氢气体，也具有腐蚀性，并会对呼吸系统产生严重的刺激。 安全防护知识 眼睛的保护 在普通的眼镜外面再戴上护眼罩或护目镜，在实验室里禁止戴隐形眼镜。如果眼睛里溅上药品，一定要采取紧急处理。 防护眼镜 穿着、服装 在实验室里应穿上防化服。另外，也不要穿拖鞋、凉鞋。 仪器和设备 一般情况下，若不知道某个仪器或设备的功能，不要试图使用它们。象真空吸收泵、旋转蒸发仪、压缩气体钢瓶等，一旦错用都可能导致这些昂贵的仪器的损坏，或者使实验失败，更严重的是导致一些事故的发生。在安装实验仪器之前，要检查玻璃磨口是否沾有碎片或碎渣。在加 第 3 页共 5 页

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化

蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS

实验室安全操作注意事项

. 实验室安全操作注意事项 每次做完实验，都要及时的分析实验数据，以便总结上次实验的经验与体会，为下一次实验方法的进一步完善提供理论依据。切勿等全部实验做完再来分析，此时才发现这样或那样的不足，造成人力与财力、时间的浪费，盲目地做实验是不足取的。 1 实验安全常识 在化学实验室里，安全是非常重要的，它常常潜藏着诸如发生爆炸、着火、中毒、灼伤、割伤、触电等事故的危险性，如何来防止这些事故的发生以及万一发生又如何来急救。 1.1 安全用电常识 违章用电常常可能造成人身伤亡，火灾，损坏仪器设备等严重事故。物理化学实验室使用电器较多，特别要注意安全用电。为了保障人身安全，一定要遵守实验室安全规则。 (1)防止触电 ①不用潮湿的手接触电器。 ②电源裸露部分应有绝缘装置(例如电线接头处应裹上绝缘胶布)。 ③所有电器的金属外壳都应保护接地。 ④实验时，应先连接好电路后才接通电源。实验结束时，先切断电源再拆线路。 ⑤修理或安装电器时，应先切断电源。 ⑥不能用试电笔去试高压电。使用高压电源应有专门的防护措施。 ⑦如有人触电，应迅速切断电源，然后进行抢救。 (2)防止引起火灾 ①使用的保险丝要与实验室允许的用电量相符。 ②电线的安全通电量应大于用电功率。 ③室内若有氢气、煤气等易燃易爆气体，应避免产生电火花。继电器工作和开关电闸时，易产生电火花，要特别小心。电器接触点(如电插头)接触不良时，应及时修理或更换。 ④如遇电线起火，立即切断电源，用沙或二氧化碳、四氯化碳灭火器灭火，禁止用水或泡沫灭火器等导电液体灭火。 (3)防止短路 ①线路中各接点应牢固，电路元件两端接头不要互相结触，以防短路。 ②电线、电器不要被水淋湿或浸在导电液体中，例如实验室加热用的灯泡接口不要浸在水中。 (4)电器仪表的安全使用 ①在使用前，先了解电器仪表要求使用的电源是交流电还是直流电;是三相电还是单相电以及电压的大小(380V、220V、110V或6V)。须弄清电器功率是否符合要求及直流电器仪表的正、负极。 ②仪表量程应大于待测量。若待测量大小不明时，应从最大量程开始测量。

蛋白质的盐析与透析

蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液，双缩脲试剂 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。

实验室安全操作注意事项正式样本

文件编号：TP-AR-L5503 There Are Certain Management Mechanisms And Methods In The Management Of Organizations, And The Provisions Are Binding On The Personnel Within The Jurisdiction, Which Should Be Observed By Each Party. （示范文本） 编制：_______________ 审核：_______________ 单位：_______________ 实验室安全操作注意事 项正式样本

实验室安全操作注意事项正式样本 使用注意：该管理制度资料可用在组织/机构/单位管理上，形成一定的管理机制和管理原则、管理方法以及管理机构设置的规范，条款对管辖范围内人员具有约束力需各自遵守。材料内容可根据实际情况作相应修改，请在使用时认真阅读。 每次做完实验，都要及时的分析实验数据，以便总结上次实验的经验与体会，为下一次实验方法的进一步完善提供理论依据。切勿等全部实验做完再来分析，此时才发现这样或那样的不足，造成人力与财力、时间的浪费，盲目地做实验是不足取的。 1 实验安全常识 在化学实验室里，安全是非常重要的，它常常潜藏着诸如发生爆炸、着火、中毒、灼伤、割伤、触电等事故的危险性，如何来防止这些事故的发生以及万一发生又如何来急救。 1.1 安全用电常识

违章用电常常可能造成人身伤亡，火灾，损坏仪器设备等严重事故。物理化学实验室使用电器较多，特别要注意安全用电。为了保障人身安全，一定要遵守实验室安全规则。 (1)防止触电 ①不用潮湿的手接触电器。 ②电源裸露部分应有绝缘装置(例如电线接头处应裹上绝缘胶布)。 ③所有电器的金属外壳都应保护接地。 ④实验时，应先连接好电路后才接通电源。实验结束时，先切断电源再拆线路。 ⑤修理或安装电器时，应先切断电源。 ⑥不能用试电笔去试高压电。使用高压电源应有专门的防护措施。 ⑦如有人触电，应迅速切断电源，然后进行抢

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)

Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月

第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%

实验室安全及防护知识及其常识

实验室安全及防护知识及其常识 (一)实验室安全知识 在生物化学实验室中，经常与毒性很强、有腐蚀性、易燃烧和具有爆炸性的化学药品直接接触，常常使用易碎的玻璃和瓷质器皿以及在煤气、水、电等高温电热设备的环境下进行着紧张而细致的工作，因此，必须十分重视安全工作。 1.进入实验室开始工作前应了解煤气总阀门、水阀门及电闸所在处。离开实验室时，一定要将室内检查一遍，应将水、电、煤气的开关关好，门窗锁好。 2、使用煤气灯时，应先将火柴点燃，一手执火柴紧靠近灯口，一手慢开煤气门。不能先开煤气门，后燃火柴。灯焰大小和火力强弱，应根据实验的需要来调节。用火时，应做到火着人在，人走火灭。 3.使用电器设备(如烘箱、恒温水浴、离心机、电炉等)时，严防触电;绝不可用湿手或在眼睛旁视时开关电闸和电器开关。应该用试电笔检查电器设备是否漏电，凡是漏电的，一律不能使用。 4.使用浓酸、浓碱，必须极为小心地操作，防止溅出。用移液管量取这些试剂时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸取。若不慎溅在实验台上或地面，必须及时用湿抹布擦洗干净。如果触及皮肤应立即治疗。 5.使用可燃物，特别是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯、金属钠等)时，应特别小心。不要大量放在桌上，更不要在靠近火焰处。只有在远离火源时，或将火焰熄灭后，才可大量倾倒易燃液体。低沸点的有机溶剂不准在火上直接加热，只能在水浴上利用回流冷凝管加热或蒸馏。 6.如果不慎倾出了相当量的易燃液体，则应按下法处理: (1)立即关闭室内所有的火源和电加热器。 (2)关门，开启小窗及窗户。 (3)用毛巾或抹布擦拭洒出的液体，并将液体拧到大的容器中，然后再倒入带塞的玻璃瓶中。 7.用油浴操作时，应小心加热，不断用温度计测量，不要使温度超过油的燃烧温度。

盐析法

盐析法综述 摘要：沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种，盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法；盐析；原理；方法评价；蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 （1）沉淀的溶解度要小，以保证被测组分能沉淀完全。 （2）沉淀要纯净，不应带入沉淀剂和其他杂质。 （3）沉淀易于过滤和洗涤，以便于操作和提高沉淀的纯度。 （4）沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的

实验室安全注意事项演示教学

实验室安全注意事项 一、重要规定： (一)穿著规定： 1. 进入实验室，必须按规定穿戴必要的工作服。 2. 进行危害物质、挥发性有机溶机、特定化学物质或其它环保署列管毒性化学物质等化学药品操作实验或研究，必须要穿戴防护具(防护口罩、防护手套、防护眼镜)。 3. 进行实验中，严禁戴隐形眼镜。(防止化学药剂溅入眼镜而腐蚀眼睛) 4. 需将长发及松散衣服妥善固定且在处理药品之所有过程中需穿著鞋子。 5. 操作高温之实验，必须戴防高温手套。 (二)饮食规定： 1. 避免在实验室吃喝食物且使用化学药品后需先洗净双手方能进食。 2. 严禁在实验室内吃口香糖。 3. 食物禁止储藏在储有化学药品之冰箱或储藏柜。 (三)药品领用、存储及操作相关规定： 1. 操作危险性化学药品请务必遵守操作守则或遵照老师操作流程或进行实验;勿自行更换实验流程。 2. 领取药品时，该确认容器上标示中文名称是否为需要的实验用药品。 3. 领取药品时，请看清楚药品危害标示和图样;是否有危害。 4. 使用挥发性有机溶剂、强酸强碱性、高腐蚀性、有毒性之药品请必定要在特殊排烟柜及桌上型抽烟管下进行操作。 5. 有机溶剂，固体化学药品，酸、碱化合物均需分开存放，挥发性之化学药品更必需放置于具抽气装置之药品柜。 6. 高挥发性或易于氧化之化学药品必需存放于冰箱或冰柜之中。

7. 避免独自一人在实验室做危险实验。 8. 若须进行无人监督之实验，其实验装置对于防火、防爆、防水灾都须有相当的考虑，且让实验室灯开着，并在门上留下紧急处理时联络人电话及可能造成之灾害。 9. 做危险性实验时必须经实验室主任批准，有两人以上在场方可进行，节假日和夜间严禁做危险性实验。 10. 做有危害性气体的实验必须在通风橱里进行。 11. 做放射性、激光等对人体危害较重的实验，应制定严格安全措施，做好个人防护。 12. 请将废弃药液或过期药液或废弃物必须依照分类标示清楚，药品使用后之废(液)弃物严禁倒入水槽或水沟，应例入专用收集容器中回收。 (四)用电安全相关规定： 1. 实验室内的电气设备的安装和使用管理，必须符合安全用电管理规定，大功率实验设备用电必须使用专线，严禁与照明线共用，谨防因超负荷用电着火。 2. 实验室用电容量的确定要兼顾事业发展的增容需要，留有一定余量。但不准乱拉乱接电线。 3. 实验室内的用电线路和配电盘、板、箱、柜等装置及线路系统中的各种开关、插座、插头等均应经常保持完好可用状态，熔断装置所用的熔丝必须与线路允许的容量相匹配，严禁用其他导线替代。室内照明器具都要经常保持稳固可用状态。 4. 可能散布易燃、易爆气体或粉体的建筑内，所用电器线路和用电装置均应按相关规定使用防爆电气线路和装置。 5. 对实验室内可能产生静电的部位、装置要心中有数，要有明确标记和警示，对其可能造成的危害要有妥善的预防措施。 6. 实验室内所用的高压、高频设备要定期检修，要有可靠的防护措施。凡设备本身要求安全接地的，必须接地;定期检查线路，测量接地电阻。自行设计、制做对已有电气装置进行自动控制的设备，在

蛋白提取方法

?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白提取实验步骤51063

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

实验室试剂安全存放须知

提醒：实验室试剂安全存放须知 导读：化学物理实验室多数都会存在化学试剂，不仅日常需要使用外，还需要储存柜一些。大家都知道化学试剂一般都具有毒性，而且有的是易燃易爆的危险品。因此我们更要主要化学试剂的存放和保管的方法，时刻保持实验室人员的安全，不要因为一时的疏忽而造成了安全隐患，今天森拉普尔实验室人员为大家分享一下实验室试剂的存放须知。 隔离存放：易燃类、剧毒类、强腐蚀性类、低温贮存的等分类放置;要求化验及仓库管理人员有一定的相关知识。存放于通风、阴凉、温度低于30℃的药品柜中。有些药品遇光容易分解，避光保存。固体、液体;酸、碱分别放置。 一、保存试剂的一般要求 ①.实验室里应尽量不存放或少存放化学试剂，这样既可防止试剂挥发物对实验室的污染，也可避免化学实验产生的物质对化学试剂的影响。若条件允许，应有室存放化学试剂。 ②. 室内要保持一定的温度和湿度。要避免强光照射，要有良好的排风设备。 ③. 化学试剂要放置在能防尘、防止各种蒸气或气体玷污和侵蚀的专用玻璃试剂柜里。要按试剂的性质分类存放。 ④.对存放的试剂要经常检查瓶上的标签是否完好，字迹是否清楚。如有脱落或模糊，应及时更换。 ⑤.室内应备齐防火器材和沙箱。 二、各种特殊试剂的存放要求及注意事项 1、易与空气中成分作用的物质 ①易与氧气作用的物质：钠、钾、钙等活泼金属的单质，需隔绝空气保存，一般保存在煤油或石蜡中。锂应保存在石蜡油里。白磷需保存在水中。铁粉、亚铁盐、亚锡盐、亚硫酸及其盐、氢硫酸及其盐、硫代硫酸钠、苯酚等应密闭保存。 ②易与水作用的物质：钠、钾、钙应保存在煤油中。电石、生石灰、无水硫酸铜、氧化钠、过氧化钠、氮化镁、硫化铝等物质能与水发生反应，应密封保存。浓硫酸、氢氧化钠固体、氯化钙、氯化镁、四氯化锡、五氧化二磷、碱石灰、硅胶、浓磷酸等物质易于吸水或发生潮解，应密封保存。 ③易与二氧化碳作用的物质：碱类物质(如氢氧化钠、氢氧化钙等)、弱酸盐类物质(如硅酸钠、漂白粉等)、过氧化钠、碱石灰等物质应密封保存。 2、易分解的物质 浓硝酸、硝酸银、溴化银、碘化银、氯水、溴水、高锰酸钾、过氧化氢等见光易分解的物质，应保存在棕色瓶中，放于阴暗处。其中溴化银、碘化银应放在暗室中密封保存。