酪氨酸酶活性抑制实验方案
酪氨酸酶活性抑制实验方案
1．1 材料：
酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠
恒温仪、紫外分光光度计、离心机。
1.2 试剂配制
1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8)
精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。
2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L)
精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。
3)受试液
精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。
4)阳性对照(+CK)
精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。
5) 酪氨酸酶液的制备
以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1( W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。
1.3 检测方法
总反应体系为5mL。具体设计见表l。
在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm 波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对
照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。
抑制率=[(A-B)/A]×l00％
其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
表1 5mL试验体系设计
注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”、“阳性对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”、“阴性对照3”调零。
酶活性及酪氨酸酶..
酶催化活性及其影响因素的研究 学院:化学与分子工程学院 班级:应用化学108班 姓名:王文移05 宁家彬06 指导老师:詹天荣
酶催化活性及影响其活性因素的研究 作者：王文移 宁家彬 [摘要]：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探 究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH 值，抑制剂对于酶活性的影响。 [关键词]：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH ，温度，抑制剂 Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity. [引言] 认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性，是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。 1.实验原理 本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜色，多巴的吸光度。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过 下式可计算酶的活性：610??=ktV A a ，式中，a 为所用溶液的酶的活性，A ?为
土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶的测定 1．三角瓶用稀HNO 3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323） 1．试剂配制： (1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H 2O 2和水） ②（0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸： （10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液： （1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水） 2．操作步骤： 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H 2O 2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3．结果计算 过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中： A： 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B： 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T： KMnO 4滴定度的校正值
以容量法测H2O2的酶活： Kappen （1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时，未分解的H 2O 2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2）测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4＋5H 2O 2＋3H 2SO 4→2MnSO 4＋K 2SO
透明质酸预防外科术后粘连的研究进展
透明质酸预防外科术后粘连的研究进展 杨晓红凌沛学王凤山 透明质酸（hyaluronic acid，HA），又称玻璃酸，是1934年由Meyer和Palmer 首次从牛眼玻璃体中分离出的一种酸性黏多糖。70年代开始将1％HA溶液应用于眼科手术和治疗某些骨关节疾病，并由此形成了两门新兴的学科：眼科黏性手术学（viscosurgery）和黏弹性补充疗法（viscosupp-lement）。近年来，国内外对HA的分布、化学结构、生理功能和临床应用[1,2]等方面进行了广泛、深入的研究，其已成为具有较高临床价值的治疗药物，主要应用于：眼黏性手术、关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科术后组织粘连中取得了较大的进展。本文重点结合HA的生理功能，概述其自防止外科术后粘连方面的研究进展。 1 HA的生理功能 HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡糖-(1→4)-O-D-葡糖醛酸的双糖重复单位所组成的一种线形聚阴离子电解质。作为人体生理所必需的物质，它广泛存在于动物的各种组织中，包括结缔组织、皮肤、软骨、眼玻璃体和滑液等。HA分子位于细胞间的胶原与弹性纤维等的空间内，由多种细胞的细胞膜所产生，合成后直接进入细胞间质。作为细胞间质的主要成分之一，HA具有填充细胞空间、稳定细胞结构、覆盖和保护细胞的作用。它的重要的生物学作用之一就是稳定纤维蛋白和膜蛋白的细胞间结构。HA和细胞间纤维蛋白结合构成具有黏弹性、保护性、润滑性和稳定性的基质，细胞镶嵌在其中。HA的水溶液具有极强的黏弹性和假可塑性，即使在低浓度时也呈较高的流变学特性。HA的这种高黏弹性和低浓度特性使代谢产物可以从镶嵌有HA分子网筛中的细胞间自由扩散。 HA特定的流变学特性取决于它的线性聚阴离子结构，分子量可高达4×106~5×106。在水溶液中，HA以无规则螺旋形式存在，有很大的分子容积，使其在低浓度下（<0.01％）能够交织缠绕并且互相透入，因而增强了HA的流变学特性[3]。 HA能润滑和保护由胶原网络构成的组织表面（软骨和肌腱）和镶嵌于胶原网络中的结缔组织细胞（滑液组织、肌鞘和筋膜）。大分子HA作用于淋巴脊髓
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告 1．1 材料： 酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。
5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1： 1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。 实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。 抑制率=[(A-B)/A]×l00％ 其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。 表1 5mL试验体系设计
探究影响酶活性的因素实验报告 ()
探究影响酶活性的因素 一、探究温度对酶活性的影响 （一）实验原理（注：市售a-淀粉酶的最适温度约600C）： 1．淀粉遇碘后，形成紫蓝色的复合物。 2．淀粉酶可以使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。 （二）方法步骤： 1、取3支试管，编上号（A、B、C），然后分别注入2mL可溶性淀粉溶液。 2、另取3支试管，编上号（a、b、c），然后分别注入1mL新鲜淀粉酶溶液。 3、将装有淀粉溶液和酶溶液的试管分成3组，A和a试管放入热水（约600C）、B和b放 入沸水，C和c放入冰块中，维持各自的温度5min。 思考题1、不能只用不同温度处理淀粉溶液或酶溶液，这是为什么？ 4、分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自的温度5min。 5、在3支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀后观察这3支试管中溶液颜色变化并记录。 思考题2、在试管A、B、C中分别能观察到什么现象？ 思考题3、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题4、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题5、探究温度对酶活性的影响实验中是否可以用斐林试剂来检验实验结果？ 为什么？ 二、探究PH值对酶活性的影响 （一）实验原理：思考题6、请依据下面所列实验操作步骤，写出该实验的实验原理。
（二）操作步骤：用表格显示实验步骤：（注意操作顺序不能错） 思考题7、请在上表中填入你所观察到的实验现象。 思考题8、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题9、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题10、在设计“影响酶活性的条件”实验中最关键的一步是什么？ 附加实验：思考题11、能否用淀粉酶探究PH对酶活性的影响？ 课堂练习： 1.（多选）在证明酶的催化作用受温度影响的实验时，有学生取两支试管分别将淀粉溶液与唾
酪氨酸酶抑制率测定方法
1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制 1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响 提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方 法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度 梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上 进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸 酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的 空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复, D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔 中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相 同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加 入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板 在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L 2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应 10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑 制按公式计算: 抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100% A – B
参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中 各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液，再加上维 生素E一日环糊精溶液，(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml，25℃恒温10 min后，加入0.4ml酶提取液，立即计时并迅速置于恒温槽内，待反应1min，用BaCRman DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度，以缓冲液为参比，然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi，把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%，求出不同浓度维生 素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率 抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂 1. Folin-酚试剂： 在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. L 氢氧化钠溶液 4. L 碳酸钠溶液 5. 10%三氯乙酸溶液 6. 磷酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。 7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取以烘干至恒重的酪氨酸，用L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。 8. 酪蛋白溶液%)：称取1.25g 酪蛋白，用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用磷酸缓冲液定容到250mL。
酪氨酸酶活性抑制实验方法
酪氨酸酶活性抑制实验方法 一、试剂：酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水 二、试剂配制： 1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。 0.2M磷酸二氢钠：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 去离子水； 0.2M磷酸氢二钠：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 去离子水； 取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。 2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6 g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶 中，即得L-酪氨酸溶液。 3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1（W:V ）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。 4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。 5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的 对照品溶液。 三、实验方法： 依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35 ℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。
受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。 受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。 抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100% 注：受试液组共四种样品
实验二淀粉酶活性测定实验报告
实验二淀粉酶活性测定 实验报告 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
淀粉酶活性的测定 一、实验目的 酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定 时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。α-淀粉酶是一种典型 的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。作 为一种最重要的工业酶制剂，α-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。其中，微生物α-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种。 本实验采用杨氏改良法测定α-淀粉酶；掌握测定α-淀粉酶活性大 小与温度关系的方法，通过分析得出酶的最适温度范围。 二、实验原理 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用 时的最适温度和pH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度 的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低，其变化趋势呈钟形 曲线变化。 不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀 粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的
反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。用分管光度计检测显色效应大小，通过分管光度值计算酶活力 注意：实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，三支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料：α-淀粉酶 仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干 试剂： ① 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl： ② 0.005%工作碘液：0.5克I2和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL； ③1%糊化淀粉溶液：称取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，60℃ COOH，定容至100mL； 5min，冷却后加25mL0.4M CH 3 ④稀释α-淀粉酶溶液：待测样品 四、实验步骤 ① 10mL1%淀粉溶液加入试管中，室温25/45/65℃保温10min
透明质酸
低分子量及寡聚玻璃酸 郭学平，凌沛学，张天民目前临床上应用的玻璃酸（又称透明质酸，HA）制剂，如眼科手术用黏弹剂、治疗关节炎的关节腔注射液、术后防粘连制剂、滴眼液等，所用HA 的平均分子量一般为50万～500万。低分子量HA（LMW-HA）的分子量范围尚无统一标准，一般为1万～50万。而HA寡聚糖（oligosaccharides of HA，简称oligo-HA）为分子量在1万以下，单糖残基数量为2～40（一般为4～16）的HA分子片段。LMW-HA还属于大分子多糖范畴，在物理性质和生物活性方面与普通HA接近，而oligo-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。人体内源性HA的分子量分布较宽，从高分子到寡聚糖均存在，HA在体内总是经历高分子→低分子→寡聚糖→单糖的代谢过程。注射到体内的外源性HA也要经历这种代谢过程。因此HA在不同的代谢阶段，因分子量的不同而产生不同的生理或药理作用。本文对LMH-HA和oligo-HA的制备方法和生物活性的研究做一介绍。 1 制备方法 LMW-HA可在普通HA的制备过程中，先对HA进行一定程度的降解，再进行纯化精制，直接制得LMW-HA。由于HA降解后，黏度下降，使得过滤等操作容易进行，因此适用LMW-HA的大量生产。实验室中少量的制备可将HA直接降解制得。降解的方法有多种，主要为化学降解、酶解和物理降解，见表1。不同的降解方法各有特点，需要注意的是，除了要得到所需的平均分子量，还要考虑分子量分布范围。用凝胶色谱法可测定LMW-HA的平均分子量及分布。平均分子量分为重均分子量M w和数均分子量M n，其比值称
酶活性测定
实验一植物抗氧化酶活性的测定 植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。 一、超氧化物岐化酶活性测定 超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应： 2 反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 【原理】 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产 生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除 从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。 【仪器与用具】 高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。 【试剂】 1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。 2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。 3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。 5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。 6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。 【材料与方法】 1．酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml。于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
透明质酸制备工艺进展(1)(2) (1)
透明质酸制备工艺进展 摘要 透明质酸，又名玻璃酸，是一种独特的。它是由线性大分子酸性粘多糖葡萄糖醛酸和N—乙酞氨基葡萄糖的双糖单位重复连接形成的。透明质酸广泛分布于高等动物的细胞外基质、结缔组织和器官中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示多重要的生理功能，如润滑关节，促进创伤愈合等，在临床上得到广泛的应用。HA及其衍生物具有优良的生物相容性和可降解性，能作为药物载体和组织工程材料，因而广泛应用于生物医药学领域。透明质酸还具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被誉为最为理想的天然保湿因子，已作为化妆品及使用保健品中的保湿添加剂使用。文章讨论了透明质酸的制备方法，并对其在医药、化妆品、保健食品等领域中的应用进行综述。 关键词：线性大分子酸性多糖;天然保湿因子;保湿添加剂;相溶性;可降解性
Hyaluronic acid preparation process Abstract Hyaluronic acid, also known as hyaluronic acid, is a unique. It is composed of linear macromolecular acid mucopolysaccharide glucuronic acid and N - acetyl glucosamine disaccharide repeating units are connected to form a. Hyaluronic acid is widely distributed in higher animal cells, extracellular matrix of connective tissues and organs. Hyaluronic acid with its unique molecular structure and physicochemical properties in vivo shows many important physiological functions, such as lubrication of joints, promote wound healing, has been widely applied in clinical medicine. HA and its derivatives have biocompatibility and biodegradability has excellent biocompatibility, can be used as drug delivery and tissue engineering material, which is widely used in biomedical field. Hyaluronic acid also has a special role in water retention, is the moisture of nature found in the best material, known as the most natural moisturizing factor ideal, as cosmetics and health care products in the use of moisturizing additives. This paper discusses the method of the preparation of hyaluronic acid, and reviews its application in medicine, cosmetics, health food and other fields. Keywords:Linear macromolecules of acidic polysaccharides; natural moisturizing factor; hydrating additives; miscibility; biodegradability
酪氨酸酶活性抑制实验方案
酪氨酸酶活性抑制实验方案 1．1 材料： 酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1( W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。 实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm 波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对
生化实验--淀粉酶活性测定标准实验报告
实验二：酶活力测定方法的研究 一．研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。 二．实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α淀粉酶和β淀粉酶，β淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化[1]。本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性[1]。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性，再做进一步分析。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 三．材料、试剂与仪器 材料： 萌发的小麦种子 试剂： ①1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ②pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）
B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml 混匀即可； ③3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M 氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； ④麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml 容量瓶中定容）； ⑤0.4M NaOH 仪器： 722光栅分光光度计(编号990695) DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 离心机(TDL-40B) 配平天平药物天平电热锅 100ml容量瓶50ml容量瓶移液管试管研钵烧杯洗瓶 四．实验方法 本实验按照下列表格的中的操作步骤进行：
探究温度对酶活性影响的实验设计
探究温度对酶活性影响的实验设计 龙岩长汀一中曾宪琰 1 实验设计理念 由于在第一课时学生已经学习了酶的发现和酶的概念以及酶的特性，在此基础上，教 师引导学生设计实验，提出预期，让学生分组进行实验探究，观察思考，进行讨论，由学生 自己总结出结论。这样的实验设计能体现学生自主、探究、合作的学习方式，有利于培养学生科学的思维方法和研究方法，提高学生的实验设计探究能力和科学素养。 2 实验目标 2.1 知识目标理解温度对酶影响的实质。 2.2 能力目标①通过探究温度对酶活性影响的因素，发展学生的科学探究能力；② 培养学生观察、分析问题，解决问题的能力；③培养学生实验操作能力；④提高学生收集资 料和语言表达能力。 2.3 情感目标①通过探究温度对酶活性影响的因素，培养学生的探索精神、创新精 神和合作精神；②培养学生实事求是和严谨的科学态度；③激发学生对生物科学的兴趣和热爱，培养学生理论联系实际。 3 课前准备 3.1 实验材料用具的准备①质量分数为2%的新配制的淀粉酶溶液；②质量分数为3%的可容性淀粉溶液；③热水，蒸馏水，冰块，碘液，菲林试剂。④试管，量筒，大烧杯，小 烧杯，滴管，试管架，酒精灯，三脚架，石棉网，温度计，火柴。 3.2 寻找资料请同学上网或上图书馆找资料，内容为：除温度外还有哪些条件影响 酶的活性？酶与社会的联系，酶与人类生活的关系，酶的活性与动物体内环境的相对稳定有 什么关系。 4 实验过程 4.1 设置探究情景，提出探究课题教师设置探究情景：生活中的加酶洗衣粉的包装 袋上，往往注明这种洗衣粉的适用温度范围，从而联想温度是否影响酶的活性，提出探究课题：设计一个探究温度影响淀粉酶活性的实验。 4.2 介绍科学探究的方法，引导学生设计探究实验方案因为我校学生的实验动手能 力差，平时课上又很少进行探究实验，所以教师明确地把科学探究的步骤告诉学生：提出问题→作出假设→设计实验→实验探究→阐述和交流实验结果与结论。有利于学生按照正确的 研究的思路去分析和解决问题，使学生更好地学习科学方法。教师引导学生根据课题进行思
透明质酸临床意义
透明质酸临床意义： 血清HA水平主要反映肝脏内皮细胞功能及受损程度。 (1)肝硬化：病程长，肝组织纤维化变性程度严重，血清HA水平明显增高，甚至达1000μg/L以上，主要因为肝硬化时门-腔静脉分流，携HA的体循环血进入肝脏分解代谢减少;肝组织受损，肝内皮细胞数量减少，代谢功能降低。肝硬化时HA增高水平与肝组织病理改变程度有密切关系。HA水平达250μg/L，可判定为肝硬化。 (2)慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎：血清HA水平亦有较明显改变，前者高于后者，其水平亦与肝细胞损害和肝纤维化活动程度有关。HA水平达165μg/L，可作为慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎的分界。 (3)急性肝炎：由于肝细胞受损，坏死物质间接刺激肝脏间质细胞合成HA增多，血清HA水平可有轻度升高。 对肝病患者而言，HA总体水平依据病损和病理改变程度表现为：肝硬化>慢性活动性肝炎>慢性迁延性肝炎>急性肝炎。可见HA做为反映肝细胞纤维化损害的指标，优于ALT。因为ALT在肝细胞停止破坏，肝内纤维化，肝硬化时反而不见升高。 (4)肝癌：HA亦可有明显增高。 (5)肺癌：由于癌浸润组织及周围结缔组织释放HA及透明质酸酶抑制物增加，特别是肺间皮细胞癌，血清HA水平可明显升高，同时肺泡灌洗液HA(即BAL-HA)水平增高远远超过血清HA(S-HA)水平，如果BAL-HA/S-HA比值明显增高，则对肺部恶性肿瘤的诊断有一定参考价值。 (6)慢性肾炎及慢性肾功能不全：血清HA水平明显高于正常对照组，并与肌酐、尿素氮呈正相关。肾病时血清HA可反映肾功能的损害程度。这与血中有毒代谢物聚集刺激组织间质细胞合成HA增多有关。而肾透析前后HA水平没有明显变化，由于HA是一种大分子物质，而透析用透膜只能滤过分子量小于35000的物质，故透析法不能把HA清除。HA作为肾脏功能损害的一项指标，反映肾损害的程度有一定参考价值。
几丁质酶抑制检测
平板透明圈法测定几丁质酶抑制率 一、实验原理 几丁质酶在节肢动物蜕皮过程中发挥了极为重要作用，通过抑制几丁质酶的活性，阻止幼虫和蛹蜕皮起到杀虫作用。几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和琼脂。在平板上打孔加入酶液。几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与待测液混合是，与对照相比，透明圈越小表明受抑制程度越高。 二、试剂和仪器 1、几丁质酶液：0.5U/ml 几丁质酶溶于磷酸缓冲液中。 2、PBS缓冲液：溶液A Na2HPO4浓度0.2mmol/ml，71.6g Na2HPO4溶于1L蒸馏水中； 溶液B NaH2PO4浓度0.2mmol/ml，31.2g NaH2PO4溶于1L蒸馏水中； 取A 37.5ml、B 62.5ml混合PH=6.6 4℃保存，一周使用完。 3、几丁质胶配置：取粉状几丁质2g置于烧杯中，加入40ml浓盐酸搅拌，几丁质被浓盐酸溶解成糊状物质，加入200ml去离子水，不断搅拌至乳白色胶体析出，将胶体用200目纱布过滤，倒去滤液。在胶体中加入200ml去离子水搅拌过滤，重复此步骤至PH﹥5，再用磷酸缓冲液冲洗胶体至中性左右。4℃密封保存备用。试验前取出定量胶体几丁质，加去离子水溶解，配置成浓度为0.5%的溶液，进行超声处理，使溶液成为均质絮状胶体溶液。 4、平板配置：取胶态几丁质5g，琼脂粉2g，用蒸馏水定容至100ml，在250ml三角瓶中加热搅拌至沸腾，室温冷却至60℃，摇匀倒平板，冷却至培养基凝固。 三、试验步骤 用内径为D=8mm打孔器在制备好的平板上对称打4个孔。 四、计算 透明质酸酶抑制率（%）=(D对照- D样品）/ D对照×100% 试中：D对照—对照组的透明圈直径 D样品—测试组的透明圈直径
淀粉酶活性测定实验报告
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。
高中生物酶活性实验：探究影响酶活性的因素
高中生物酶活性实验：探究影响酶活性的因素 实验六探究影响酶活性的因素 原理：淀粉遇碘后，形成蓝色的复合物。淀粉酶可以可以使淀粉水解成麦芽糖，麦芽糖遇碘后，不形成蓝色的复合物。 材料：新配置的淀粉酶溶液，新鲜肝脏研磨液，可溶性淀粉溶液，过氧化氢溶液等。 温度对酶活性的影响 在温度对酶活性的影响的实验中，三支试管的条件，除温度外均相同。3号试管处在60℃的温度条件下，酶活性最大，试管中的淀粉被分解，滴入碘液后不会变蓝。2号试管的温度条件是100℃，这样高温度条件下，淀粉酶已失去活性，1号试管的温度条件是O℃，低温抑制淀粉酶的活性。所以2号和1号试管中的淀粉都没有被分解，滴上碘液后都会变蓝，此实验可以证明;酶的催化作用需要适宜的温度条件，温度过高和过低都将影响酶的活性。 探究pH对酶活性的影响 实验1过氧化氢(H2O2)在过氧化氢酶的催化作用下，可以分解成水和氧气，可以放入带火星的木条，看能否复燃来检测是否有氧气产生。 步骤项目试管1试管2试管3 1加入过氧化氢溶液2mL2mL2mL 2加入蒸馏水1mL——
实验原理：DNA绿色，RNA红色 分布：真核生物DNA主要分布在细胞核中，线粒体和叶绿体内也含有少量的DNA；RNA主要分布在细胞质中。 观察叶绿体和细胞质流动 材料：新鲜藓类叶、黑藻叶或菠菜叶，口腔上皮细胞临时装片原理：叶绿体在显微镜下观察，绿色，球形或椭球形。 用健那绿染液染色后的口腔上皮细胞中线粒体成蓝绿色，细胞质接近无色。 考点提示： 为什么可直接取用藓类的小叶，而不能直接取用菠菜叶？ 因为藓类的小叶很薄，只有一层细胞组成，而菠菜叶由很多层细胞构成。 取用菠菜叶的下表皮时，为何要稍带些叶肉？ 表皮细胞除保卫细胞外，一般不含叶绿体，而叶肉细胞含较多的叶绿体。 怎样加快黑藻细胞质的流动速度？最适温度是多少？进行光照、提高水温、切伤部分叶片；25℃左右。 对黑藻什么部位的细胞观察，所观察到的细胞质流动的现象最明显？叶脉附近的细胞。 考点提示： 为何要选新鲜的肝脏？因为在不新鲜的肝脏中，过氧化氢酶的活性会由于细菌的破坏而降低。