重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制

技术评价一般原则

二OO六年十月

目 录

1前言 1

1.1目的和意义

1.2适用范围

1.3局限性

2宿主细胞的选择 1

2.1宿主细胞来源、历史和一般特性

2.1.1宿主细胞来源和历史

2.1.2宿主细胞一般特性

3重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定 2

3.1目的基因来源

3.2表达载体的具体构建步骤

3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选

3.4重组工程细胞的初步鉴定

4重组工程细胞库的建立 3

4.1细胞库建立

4.2建库细胞的管理

5细胞库检定 3

5.1细胞鉴定

5.1.1细胞种属的鉴定

5.1.2致瘤性试验

5.1.3目的基因和表达框架分析

5.1.4表达产物检测

5.2微生物污染检测

5.2.1细菌、真菌和支原体检查

5.2.2病毒因子的检查

5.2.2.1体外试验

5.2.2.2体内试验

5.2.2.3种属特异性病毒的检定

5.2.2.4逆转录病毒的检测

5.2.2.4.1感染性试验

5.2.2.4.2逆转录酶检测

5.2.2.4.3透射电镜检查

6细胞稳定性研究 6

6.1贮存条件下的稳定性

6.2传代/扩增过程中的稳定性

6.2.1基因水平的比较

6.2.2目的产物表达水平的比较

6.2.3细胞自身的稳定性

6.2.4内源因子检查

6.2.5 致瘤性监测

7 生产过程细胞质量控制 7

7.1常规生产过程监控

7.2细胞增殖限度

7.3其它风险性因素控制

8小结 8

9、名词解释 9

10、参考文献 10

1前言

对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成具有预期生物活性的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。

在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/灭活工艺的验证。

1.1目的和意义

经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。

本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。

1.2适用范围

本技术评价一般原则仅适用于生产前述的抗体等治疗用重组制品的哺乳动物细胞，不包括细菌、酵母等重组工程菌，也不包括治疗用体细胞、疫苗生产用细胞基质、杂交瘤细胞等。相关内容可参见国家局已颁布的指导原则和药品审评中心公布的药品技术评价一般原则。重组制品生产用哺乳动物细胞亦须符合这些已有文件的相关要求。

1.3局限性

本技术评价一般原则主要结合目前对于重组工程细胞结构、功能，细胞致瘤性和内源性病毒对重组产品带来的风险及微生物污染因子的危害性共识，提出技术审评关注的重点问题和基本原则，需要结合具体细胞和实际培养控制条件考虑和选择。

2宿主细胞的选择

应选择来源、背景十分清楚的适宜宿主细胞，明确存在的内源性病毒和/或致瘤性等影响制品安全性的因素，并结合制品纯化的程度、细胞培养和生产过程中风险性成分的去除/灭活能力及残留量控制水平，以及临床应用适应症和用法用量等特点综合分析，经利弊权衡后确定与特定制品相适应的宿主细胞。尽可能选择致瘤性试验阴性和低增殖代次水平的宿主细胞。

对于改良的传代细胞、全新构建的转化细胞，甚至肿瘤细胞等，由于前期研究、背景资料和致瘤性风险等积累的认识十分有限，其开发应用将引入新的安全性隐患，需要慎重权衡利弊，在开展充分研究的基础上严格控制潜在的风险性。

2.1宿主细胞来源、历史和一般特性

用于构建重组工程细胞的宿主细胞其来源和培养历史应清楚，可溯源有关背景资料，例如最初分离建立株/系的机构，在不同机构内引进和传代经过，既往进行过的检测分析项目和确证研究结果，细胞保存状态，经体外传代培养已达到的增殖代次/水平及传代过程中所用过的人源或动物源性材料等。

2.1.1宿主细胞来源和历史

应提供宿主细胞来源的相关资料和证明性文件，说明是否曾进行过遗传操作引入了外源基因序列，描述已进行过的研究检定项目例如细胞鉴定、内源和外源性因子检测等的结果及引进时进行的复核检定结果。

2.1.2宿主细胞一般特性

需阐述宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长一般特征、培养条件和培养液要求。新构建的细胞系应检测致瘤性特征。

3重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定

目前可采用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法和筛选标记等进行工程细胞的构建和筛选，构建成功的标志是工程细胞能够稳定、高效地表达结构正确且具有生物活性的目的产物。应尽可能提供关于重组工程细胞构建和鉴定的详细资料并重点描述：

3.1目的基因来源

应包括最初获得目的基因序列的来源和背景方面的资料，用于制备目的基因cDNA的方法，以及必要的初步序列分析。

3.2表达载体的具体构建步骤

需说明表达载体组成成分以及主要元件的来源和功能，包括插入基因和侧翼区序列、复制子、启动子、增强子、抗性标记以及主要的酶切位点等。应详述表达载体构建或改建的过程。对构建成功的表达载体应进行必要的鉴定，并提供相关试验资料如构建中所用位点的酶切图谱等。

3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选

应详细说明载体引入宿主细胞的方法和操作过程，重组工程细胞的筛选原理、条件和标准，以及采用何种方法增加基因拷贝数等。阐述外源基因引入宿主细胞后产生的变化，符合筛选标准的候选细胞可能为多个细胞株，但拟用于建库的细胞株应为经研究比较后确定的单一细胞克隆。

3.4重组工程细胞的初步鉴定

应检测重组后细胞基本性状的改变，比较研究插入外源基因后细胞致瘤性特征的改变。应说明表达载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体）并采用适宜的方法测定其拷贝数。说明启动和控制目的基因在宿主细胞中表达所采用的方法，并进行初步的表达产物鉴别和表达水平检测。

对于选定的工程细胞株应进行充分的目的基因全序列确认，以保证用于编码和表达目的产物的基因在初始核酸序列上的正确性。

4重组工程细胞库的建立

连续传代细胞生产重组制品的最大优点是使每批产品都有一个经过检定的共同起源细胞，因此建立细胞库的目的就是为了保证生产的可持续性和产品质量的稳定。重组制品的生产必须建立在良好的细胞库管理基础上。

4.1细胞库建立

细胞库可为三级即原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）；也可采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊情况下，也可使用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体，必要时须经与实际生产过程采用的无血清培养基和培养条件相一致的适应性培养。

4.2建库细胞的管理

在制备WCB过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起WCB中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，应将所有培养皿中的细胞混合成单批后再分装。

在细胞库的建库期间应采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其他类型细胞的交叉污染等）。

上述各级种子库的细胞应按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求参见本文细胞库检定）。

对于细胞库建库的具体过程、方法和管理的要求，参见参考文献[1]。5细胞库检定

正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其它细胞，能够直接扩增储备或者应用于生产。

对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞

的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其它细胞。保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应。

5.1细胞鉴定

5.1.1细胞种属的鉴定

应验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，排除与其它细胞的交叉污染。

目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。

5.1.2致瘤性试验

应检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性改变对产品带来的安全性风险。

5.1.3目的基因和表达框架分析

目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA或用从细胞基质中分离的RNA制备的cDNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。

基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列

以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。

为保证产品结构的正确和稳定，基因序列分析应贯穿于重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定以及生产细胞培养监控的全过程。

5.1.4表达产物检测

应检测分析目的产物的表达量和生物活性。活性测定应选择与其治疗机理相对应并能够定量的方法。活性测定方法学研究可贯穿于药品研究的始终，并经相关验证分析。

5.2微生物污染检测

5.2.1细菌、真菌和支原体检查

应对MCB、WCB和EPC（生产终末期细胞）进行全面检查，对生产培养过程中的细胞进行监测。具体方法见参考文献[1]。在进行支原体检查时，应注意同时进行培养法和指示细胞法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。

5.2.2病毒因子的检查

包括细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒的检查。对细胞进行病毒检查的种类和方法，应根据细胞的种属和组织来源、传代历史和细胞特性选择。

5.2.2.1体外试验

应将MCB、WCB和EPC细胞活细胞或细胞裂解产物接种到尽可能多的病毒易感的指示细胞上。 可以根据细胞来源，传代史和细胞培养基的原料使用情况来选择适宜的指示细胞。检测结果应为阴性。具体方法见参考文

献[1]。

5.2.2.2体内试验

通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。通常要对MCB、EPC进行体内试验。具体方法见参考文献[1]

5.2.2.3种属特异性病毒的检定

通过抗体产生试验来检测可能存在于MCB细胞中的种属特异性病毒，如啮齿类动物来源的细胞应进行小鼠、仓鼠或大鼠的抗体生成试验。严格控制对于人类有危害的鼠源性病毒。

5.2.2.4逆转录病毒的检测

逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶(RT) 检测和电镜技术检查。应采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。

5.2.2.4.1感染性试验

应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验（XC plaque）、延时XC空斑试验、S＋L－灶点分析（S＋L－Focus）等。试验时应注意设立恰当的阴/阳性对照。

5.2.2.4.2逆转录酶检测

为提高检测的敏感性，通常需要将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。

5.2.2.4.3透射电镜检查

透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒

和病毒样颗粒的存在，应比较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。

上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不可用于生产。

6细胞稳定性研究

应包括库细胞、生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期等不同培养时期的细胞。库细胞应重点考察贮存、复苏等操作处理因素的影响和传代过程中的遗传稳定性，在此基础上确定库细胞传代限度；生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期细胞应考察模拟生产工艺和培养条件对细胞生长状况、表达能力等的影响，并确定生产细胞增殖限度和/或连续培养时间；使细胞始终能够持续、稳定地表达重组制品，并将对终产品产生安全性影响的风险因素严格控制在最低限度。

6.1贮存条件下的稳定性

当储存的细胞复苏后用于生产制品时，应进行细胞存活率和功能活性等与细胞质量密切关联项目的研究测定，以证实复苏细胞表达能力的稳定性。应有对建库细胞贮存条件下稳定性监测的方案。这种监测应在一支或多支冷冻保藏的WCB复苏后制备生产用细胞时进行，或当一支或多支冷冻保藏的MCB 复苏并用于制备新WCB时进行。如果长时间未进行生产时，应按上市申请时所述的间隔时间对生产用细胞库进行活力测试。如果细胞的

活力没有明显的减退，一般不需对MCB 或WCB 作进一步检定。

6.2传代/扩增过程中的稳定性

应对库细胞和生产过程细胞进行传代/扩增的稳定性研究，可将复苏的库细胞连续传代培养至一定的代次和将工作库细胞在模拟实际生产条件下连续培养、扩增（逐级放大扩增过程），直至预期培养时间以及超过预期时间之外的延长时间点，收获后进行检测分析。通过考察目的基因、表达框架等在重组工程细胞中的传代稳定性和目的产物表达的稳定性，制定库细胞的限传代次和生产细胞的增殖限度以保证实际生产过程中细胞整体扩增水平以及伴随的内源性病毒和/或致瘤性风险等的抑制状态在预期限度范围内。至少应包括以下方面的试验研究：

6.2.1基因水平的比较

目的基因编码序列和表达框架不应有错误，包括突变、缺失、插入。并注意比较基因拷贝数的变化。

6.2.2目的产物表达水平的比较

目的产物的表达量和表达活性不应有明显降低，根据不同的产品和具体研究结果确定适宜的可接受标准。

6.2.3细胞自身的稳定性

应重点检测细胞在传代/扩增过程中的形态、生长、代谢等基本状况，遗传特征和致肿瘤特性的变化。

6.2.4内源因子检查

应动态考察内源因子的复制是否得到有效抑制。重点检测由细胞来源动物和宿主细胞特性所决定的易染病毒如内源性逆转录病毒，分析其对于

人类的致病性和重要性，严格控制其产生的条件。

6.2.5致瘤性监测

对于致瘤性试验阳性的细胞，应通过比较研究考察细胞培养传代过程中致瘤性特征的改变，例如试验阳性时的细胞代次、最低接种量、肿瘤转移扩散、肿瘤增殖时间、瘤组织病理特征等。

7 生产过程细胞质量控制

种子库细胞应在全面质量研究和检测分析基础上，模拟实际生产过程进行扩增培养，并检测分析目的基因表达的稳定性、细胞生长状况、污染控制、致肿瘤风险性等；规模化生产后须建立细胞生产培养过程的监控标准，产品生产细胞培养终末期应符合质量控制相关要求。

对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，应依据工艺处理能力制定风险性成分的控制条件，并根据模拟生产状态下取得的试验研究数据制定废弃收获液的标准；生产工艺须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证。

如果整个培养过程中的关键环节例如培养基、培养条件、培养时间和/或限制代次、培养方式等发生重大改进，细胞培养工艺进行了放大，影响了原已确定的监控标准，应重复进行一次全面的检测验证。

7.1常规生产过程监控

经研究确定了生产工艺条件之后，常规生产过程中可重点监测微生物污染和细胞生长状况，例如活细胞数目和形态、代谢和功能状态、目的蛋白表达状况、潜伏性逆转录病毒基因组激活状况、细菌和支原体污染以及其它要求[1]等，在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末

细胞的检测项目及可接受标准。

7.2细胞增殖限度

在细胞稳定性试验研究的基础上，应结合细胞培养、维持等工艺过程中实际采用的生产方式如批式培养（batch culture）、流加培养(fed-batch culture) 、灌注培养(perfusion culture)等各自特点，考察细胞体外连续扩增、培养过程中发生的变化，例如细胞的生长状态、内源性病毒抑制状态、目的蛋白表达的下降程度以及致瘤性改变等确定适宜的收获方式、收获时间、细胞终止培养时间和/或增殖代次，并预留充分的安全储备。实际生产过程中细胞不得超过预先设定的培养时间和/或增殖限度。

7.3其它风险性因素控制

培养基对细胞的质量有直接的影响，也是细胞污染的可能来源之一。应明确培养基的组成、来源及质量标准。对于动物源性添加成分，应尽可能控制并减少其使用；如确需使用，应阐明选择的理由，并说明该成分的来源和病毒安全性控制方法。目前提倡采用无血清培养基，并尽可能减少用于处理细胞（例如从贴壁状态中游离或者分散）的动物来源的蛋白酶。各种培养基的来源和质量检测数据均应有可追溯的文件记录。如培养中使用了牛源性物质，应明确其来自非BSE疫区，并应按照国家食品药品监督管理局的相关规定提供必要的证明性文件。

细胞培养条件的研究中，应考察使内源性逆转录病毒复制和癌基因相关序列激活或者复制受抑制的控制条件，对模拟生产条件下的状况进行分析，确定可实际控制的程度。生产中应严格执行研究确定的控制条件。 8小结

宿主细胞来源应明确，其建立、传代和培养历史清楚，鉴定结果可靠，遗传、生物学背景可追溯；

工程细胞的克隆构建、筛选过程应规范，克隆原始细胞在比较优化的基础上经过确认检测；起始细胞稳定、均一和同质，建立了规范的细胞库（以下简称库细胞）并经过充分检定，保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应；

对于原始库和/或主库细胞，应进行过至少一次全面系统的研究检定；工作库细胞经过简化项目的检定和外源因子污染检测，没有混入其它细胞；

生产用WCB细胞每次复苏后应经过有代表性意义的常规质控项目的检测分析，以证实库细胞在复苏时仍保持原冻存时预期的细胞特征。

在细胞培养工艺研究阶段，对生产终末细胞和/或超过培养限定代次的细胞应进行过一次全面系统的检测分析研究，包括一般检定、遗传和生物学特征检测分析、目的基因和表达框架的稳定性分析、外源因子污染状况分析、内源性病毒激活或复制抑制状态检测、致瘤性改变以及其它需要严格限制的因素等；

细胞应经过全面的稳定性研究考察，以确定库细胞的限传代次和生产细胞适宜的扩增控制水平，并在生产过程中严格执行限定的要求。重组工程细胞在整个培养生产过程中其遗传学和生物学特征应保持稳定；

生产中设立了适宜的监控指标，动态跟踪监测细胞的增殖、生长、污染等状况，并控制在警戒范围内。对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，病毒和/或癌基因相关序列的激活或者复制应受到严格控

制，制定废弃收获液的标准，生产工艺包含有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证，纯化步骤能够使病毒和/或致瘤性成分得到有效去除，并严格执行研究确定的控制条件；

细胞培养基的来源和质量标准应明确，动物源性添加成分须符合国家有关规定；

总之，细胞质量研究、检测和监控应包括从起始的库细胞至生产终末的整个扩增培养全过程，使细胞始终能够正常表达、分泌具有生物活性的目的产物，微生物污染、致瘤性等风险性因素得到有效控制。

9、名词解释

宿主细胞：系指用以载纳和表达外源目的基因的细胞系或者细胞株。

重组工程细胞：系指携带有外源目的基因并能够持续稳定表达重组目的产物的工程化细胞。

细胞增殖限度：在既定培养条件下，库细胞从复苏开始至生产终末期为止的整个培养过程中，为有效控制细胞生长状态或者变异的程度，使其始终处于持续、稳定的表达状态所界定的相关要求，包括库细胞限传代次和生产细胞培养限度。通常采用固定条件下细胞培养和维持时间、细胞群体倍增水平或者限传代次等指标加以限制。

细胞库、原始细胞库、主细胞库、工作细胞库的概念和定义见参考文献[1]。

10、参考文献

1、中华人民共和国药典2005年版三部.生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程，2005

2、FDA. Points to consider in characterization of cell lines used to produce biological products, 1989

3、FDA. Points to consider for the characterization of cell lines used to produce biologicals and for the manufacturing and testing of monoclonal antibody for human use，1997

4、ICH. Guideline for viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human and animal origin, 1996

5、EMEA. Position statement on the use of tumourigenic cells of human origin for the production of biological and biotechnological medicinal products, 2001

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制

技术评价一般原则起草说明

哺乳动物细胞用于生产治疗性重组制品，特别是单克隆抗体药物的临床应用 近年来呈现上升的趋势，国内相应的研究、开发和进入临床试验的项目也逐渐增多。但目前仅根据文献报道和可获得的有限背景资料，未经全面系统的试验研究和检测分析就直接引进和使用能够获取的宿主细胞现象比较普遍。对于重组工程细胞的质量分析只有零碎、不完整的试验研究。而关于细胞质量控制已有的指导原则和技术评价一般原则，主要针对生产疫苗的细胞基质、腹水法生产抗体的杂交瘤细胞以及体细胞治疗等，其中相关的内容虽具有普遍的指导意义，但对于重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制特殊问题的考虑尚不够充分和具体，亟需单独起草具有实际针对性的技术评价一般原则，以完整、全面阐述技术评价的基本内容和相关要求，引导用于重组产品的哺乳动物细胞质量控制的相关研究工作。

1、起草指导思想

细胞质量的研究和控制是生产重组制品的核心组成部分，维持良好的培养细胞和表达状态需要从库细胞到生产过程的全面质量研究。基于国内外该领域目前存在的实际差距，并考虑国内今后发展的趋势和要求，为从研发的起始阶段对于细胞质量控制研究方案提供参考依据，设计和规划科学的研究项目，规范技术审评和研究开发所面临的共同问题，中心成立了本课题研究小组。根据目前在技术审评中发现的细胞质量控制方面的共性突出问题，结合现有指导原则和技术评价一般原则适用的部分，国外指导原则的一般考虑，起草了本技术评价一般原则。期望能够引导和促进细胞质量控制工作的全面性、系统性和完整性，加强重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的研究工作。

2、与其它指导原则的关系

关于细胞质量研究、控制及重组制品的技术要求，国家局已颁布《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》；药品审评中心已公布《疫苗生产用细胞基质技术审评一般原则》、《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》；特别是《中华人民共和国药典》（2005年版）三部通则，对于“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”已有明确要求。本文的起草中参考了相关的内容，在与上述文件的相关要求保持一致的基础上，针对重组哺乳动物细胞的质量控制特点，补充提出更加具体化的技术评价基本原则，相同的部分以参见的方式直接引用，不再重复有关内容。

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必

电力生产技术改造原则

1、通用部分 1.1不满足国家电网公司反措、规程要求或存在家族性缺陷的设备,无法修复的,应进行技改。 1.2因电网发展需要,设备的主要技术参数(额定电压、电流、容量、变比等)不能满足安装地点要求的设备,无法通过大修提高设备性能的,应进行技改。 1.3可靠性差、缺陷频发、非停率高,存在设计缺陷,无法彻底修复的设备,应进行技改。 1.4设备已停产,制造厂已不能提供备品备件与技术服务,备品备件不满足下一个运行周期最低需求的,应安排更换。 1.5设备评价为异常及严重状态,影响人身、电网、设备安全,且无法通过大修进行处理的,应优先安排改造。 1.6直流输电系统设备存在单一元件故障导致直流闭锁隐患,需要更换整套设备的,应优先进行技改。存在先天性缺陷影响系统运行而无法治理,需要更换整套设备的,应考虑进行技改。 1.7对作为资产主要组成部分的设备主要部件(如变压器套管、分接开关及冷却装置,断路器操作机构及套管等),经评估不能继续使用且无法通过大修恢复的,应安排进行局部改造。 1.8设备运行年限达到设备折旧寿命,经评估不能继续服役且无法通过大修恢复设备性能,应安排改造。 2变电(含直流)设备及附属设施 2.1规范性引用文件 GB/T 4109 高压套管技术条件

GB/T 10229-1988 电抗器 GB/T 11024-2010 标称电压1kV以上交流电力系统用并联电容器 GB/T 12663-2001 防盗报警控制器通用技术条件 GB/T 22390-2008 高压直流输电系统控制与保护设备 DL/T 538-2006 高压带电显示装置技术条件 DL/T 713-2000 500kV变电所保护与控制设备抗扰度要求 DL/T 724-2000 电力系统蓄电池直流电源装置运行与维护技术规程 DL/T 781-2001 电力用高频开关整流模块 DL/T 856-2004 电力用直流电源监控装置 Q/GDW 446-2010 电流互感器状态评价导则 Q/GDW 451-2010 并联电容器装置状态检修导则 Q/GDW 452-2010 并联电容器装置状态评价导则 Q/GDW 454-2010 金属氧化物避雷器状态评价导则 Q/GDW 506-2010 交直流滤波器及并联电容器状态评价导则 Q/GDW 509-2010 控制保护系统状态检修导则 Q/GDW 510-2010 控制保护系统状态评价导则 Q/GDW 606-2011 变电站直流系统状态检修导则 Q/GDW 607-2011 变电站直流系统状态评价导则 Q/GDW 608-2011 所用电系统状态检修导则 Q/GDW 609-2011 所用电系统状态评价导则

最新技术改造管理制度

Xxxxx责任公司 技术改造管理制度 1目的 为加强xxx公司技术改造工程管理，提高技术改造工程项目管理水平，促进项目管理的科学化、规范化和制度化，适应经济发展的需要，提高技术装备水平，保证发电设备的安全、稳定、经济运行，制定本制度。 2适用范围 适用于xxx公司技术改造工程管理工作，主要包括项目计划、可研、立项、实施、监督、验收、后评估和资料归档等过程管理。3定义和缩略语 3.1定义 技术改造工程是指xxx公司更新技术工程项目、技术改造工程项目、零星购置项目和小型基建项目。 3.2 缩略语 4遵循原则 4.1以安全生产为基础，以经济效益为中心，以节能降耗、环境保护为重点，以国家产业政策、集团公司、xx公司和公司有关要求为依

据，有重点、有计划、有步骤地进行。 4.2技术改造工程资金必须纳入预算管理，在资本性收支预算中安排，分级管理，分项计算，分科目入账。 4.3加强技术改造工程全过程管理，在保证安全、质量的基础上，努力缩短工期，降低工程造价。 4.4特大和重大技术改造工程项目要实行从可研、立项、项目负责人、招投标、工程监理、合同管理、竣工验收、后评估到决算等全过程管理。 4.5重大项目实行科学决策、民主决策的原则。 4.6工程项目实行全过程监督的原则，通过全过程监督达到项目经济社会效益最大、科学合理、技术先进。 5组织机构 5.1公司成立生产工程领导小组，负责公司技术改造工程事项的集体决策（生产工程是指利用生产资金对发电设备和设施，以及相应配套的辅助性设施进行的维修、大修、技术进步与技术改造工程）。 5.2生产工程领导小组组成： 组长：总经理 副组长：副总经理及财务总监 成员：总经理助理、副总工程师、各部门负责人 6职责 6.1 公司生产工程领导小组 6.1.1贯彻落实国家、行业有关技术改造工程管理的法律、法规、标

用于生产生物制品的建库哺乳动物细胞基质的制备_鉴定和检测.

8Duan D,Yue Y,Yan Z,et al.A new dual-vector approach to enh ance r ecom binant adeno-as sociated virus-mediated gene exp ress ion thr ou gh in termolecular cis activation.Nat M ed, 2000,6:595-598. 9Gao GP,Lu F,S anm iguel JC,et al.Rep/Cap gene amplification an high-yield pr odu ction of AAV in an A549cell line exp ress ing Rep/Cap.M ol T her,2002,5(5Pt1:644-649. 10Collaco RF,Cao X,T rem pe JP.A helper virus-free pack aging sys tem for r ecom binant adeno-as sociated virus vectors.Gene, 1999,238:397-405. 11鲁晓春,李小鹰,马鑫,等.腺相关病毒载体对心肌细胞感染和外源基因表达的作用.中国临床康复,2003,7:4056-4057. 12Hoshijima M,Ikeda Y,Iw an aga Y,et al.Chr on ic s uppression of heart-failure progression by a pseudo ph os phorylated mutan t of phos pholamban via in vivo card iac rAAV gene delivery.Nat M ed,2002,8:864-871. 13Bartlett J S,W ilcher R,Samulski RJ.Infectiou s en try pathw ay of adeno-ass ociated vir us and adeno-ass ociated virus vectors.J Virol,2000,74:2777-2785. 14黄志军,袁洪,曾钧发,等.重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165 基因对缺血心肌血管新生的影响.中国动脉硬化杂志,2004,12:627-631.15S ugiyam a A,Hottori S,Tanaka S,et al.Defective aden oass ociated viral-m ediated trans fection of insulin gene by direct injection into liver parenchym a decreases b lood glucose of d iabetic mice.Horm M etab Res,1997,29:599-603. 16Yang Z,Chen M,Wu R,et al.Su ppres sion of autoimmune diabetes by viral IL- 10gene transfer.J Immunol,2002,168: 6479-6485. 17S hklyaev S,As lanidi G,T ennan t M,et al.Sus tained p eriph eral expression of trans gene adiponectin offs ets the development of diet-induced obesity in rats.Proc Natl Acad S ci USA,2003, 25:14217-14222.

红细胞成熟过程哺乳类动物红细胞在成熟过程中要经历一系列的变化

第三章红细胞 一、红细胞成熟过程 哺乳类动物红细胞在成熟过程中要经历一系列的变化： 早幼红细胞具有分裂繁殖的能力，细胞中含有细胞核、内质网、线粒体等细胞器； 从骨髓进入尚未完全成熟的红细胞称为网织红细胞，细胞仍有合成血红蛋白的功能，另外也可见有少量线粒体； 红细胞进入外周血1~3天后。核蛋白体等细胞器消失，成为成熟红细胞。 二、红细胞的基本结构 成熟红细胞是结构功能高度特化的细胞，无细胞核，也无细胞器。 红细胞内的主要成分是血红蛋白。血红蛋白是含卟啉铁的蛋白质。约占红细胞重量的33%，易与酸性染料结合，染成橘红色。 成熟红细胞直径7.5~8.5um，呈双凹圆盘状，表面光滑，中央较薄，约1um，周边较厚。约1.9um，在血涂片标本上显示，中央染色较浅周边较深。这一形态结构特点增加了红细胞的表面积，与体积相同的球形结构相比表面积增大约25%，还可使细胞内任何一点距细胞表面的距离都不超过0.85um。由于胞质细胞内充满了血红蛋白，最大限度地增强了气体交换的功能。 红细胞的数量及血红蛋白的含量随生理功能而政变。婴儿高于成人，运动时多于安静状态，高原地区居民高于平原地区居民。红细胞形态和数量以及血红蛋白的质与量的改变超出正常范围，则表现为病理现象。一般认为红细胞计数<3.0×1012/L，血红蛋白<100g/L，则为贫血（anemia）。红细胞计数>7.0×1012/L、血红蛋白>180g/L，则为红细胞和血红蛋白增多。 单个红细胞在新鲜时为淡黄绿色，大量红细胞使血液呈猩红色。多个红细胞常叠连在一起呈緡钱状。 红细胞有一定弹性和形态可变性，它能通过自身的变形而顺利通过直径更小的毛细血管。红细胞正常形态的维持需足够的ATP供能以及细胞内外渗透压的平衡。当缺乏ATP供能时，其形态由圆盘状态变为棘球状，当ATP供能状态改善后亦可恢复。当血浆渗透压降低时，血浆中的水分进入红细胞内，细胞肿胀呈球形甚至破裂，称为溶血，残留的红细胞膜囊称为血影；若血浆渗透压升高，红细胞内水分析出胞外，致使红细胞皱缩，也可导致膜破坏而溶血。 三、红细胞膜的结构 红细胞膜是成熟红细胞存留的唯一细胞器，它对保持红细胞的形态和维持红细胞的生命具有重要的意义。红细胞对外界的所有联系及反应，包括物质运输、免疫反应、信号转导、药物反应等，都由红细胞膜来完成。 人的红细胞膜是由蛋白质（约占49.3%）、脂质（约占42%）、糖类（约占8%）和无机离子等组成，蛋白质与脂质的比值约为1：1。电镜下观察红细胞膜呈三层（暗-明=暗）：外层含糖脂、糖蛋白、蛋白质，为亲水性；中间层含磷脂、胆固醇与胆固醇酯、蛋白质具有疏水性；内层主要包含蛋白质，呈亲水性。即红细胞膜基本结构与其他细胞一样以脂双层为主体，蛋白质镶嵌在脂双层中。蛋白质大多与脂质及糖类结合以脂蛋白或糖蛋白的形式存在。这些蛋白质既有维持红细胞结构的作用，又有各自特定的功能。 1、红细胞膜蛋白 发现红细胞膜上有10种主要蛋白和一些少量蛋白质。 红细胞膜在包膜内表面可见一网状结构支撑着整个细胞，称为膜骨架，主要由血影蛋白、锚定蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、加合素、4.1蛋白、4.2蛋白、4.9蛋白相连接构成。这种网状结构通过锚蛋白固定在细胞膜上。 膜骨架系统对维持红细胞的形状、稳定性起着重要作用。

新版生产技术改造和设备大修项目估算编制指导意见-新版-精选.pdf

生产技术改造和设备大修项目 估算编制指导意见 一、总则 为指导各单位有序开展生产技术改造工程可研阶段投资估 算和设备大修工程预算（以下统称“项目估算”）编制工作，确保 项目估算内容依法合规、造价合理准确。根据行业、公司有关规定制定本指导意见。 二、编制依据 《电网技术改造工程预算编制与计算规定》（2015年版）《电网检修工程预算编制与计算规定》（2015年版） 《关于发布电力工程计价依据营业税改征增值税估价表的 通知》（定额〔2016〕45号） 《电网技术改造及检修工程概预算定额价格水平调整办法》（定额〔2015〕34号） 三、估算书编制资格 项目估算书由项目单位根据生产技术改造和设备大修项目 需求组织编制。 对于编制可行性研究报告的项目，其项目估算书应委托具备相应资质的工程咨询或者造价咨询机构进行编制。估算书由电力工程造价从业人员编制，由具备电力工程造价专业执业资格人员 校核，并应履行审核和批准程序。

对于编制项目建议书的项目，其项目估算书可委托具备相应 资质的工程咨询或者造价咨询机构进行编制（编审人员资格同 上），也可由项目单位自行编制。 四、估算书编制准备 估算书编制前应明确项目技术方案、工程量、设备及主要材料（配件）明细等，确定编制范围、相关取费标准和定额，确定 设备、主要材料（配件）价格依据和价格水平以及供应方式等。 （一）概（预）算定额适用原则 1.生产技术改造项目可研估算编制阶段原则上使用概算定 额，不足部分使用预算定额。对于项目中某项工作内容仅为对应 概算定额子目部分内容的，宜参考使用相关预算定额。对于达到施工图设计深度的，宜使用预算定额。 2.生产设备大修项目使用预算定额，其中建筑修缮内容使用电网技术改造建筑修缮预算定额。 （二）定额选取原则 1.电网生产技术改造项目首先选用国家能源局发布的电网 技术改造工程定额和电网拆除工程定额；该定额未涵盖部分，按以下顺序依次参考使用：电网检修工程定额，电力建设工程定额和20kV及以下配电网工程定额，其他行业定额，地方定额。 2.电网生产设备大修项目首先选用国家能源局发布的电网 检修工程定额；该定额未涵盖部分，按以下顺序依次参考使用： 电网技术改造工程定额和电网拆除工程定额，电力建设工程定额

哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/6b9875213.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表

南方电网生产技术改造指导原则

生产技术改造指导原则 二〇一一年六月

一、总则 1、为深入贯彻南方电网公司“强本、创新、领先”的战略发展思路，以提高公司所辖电网装备、自动化和智能化水平为指导，结合发输变电设备的最新发展技术和电网运行的具体情况，制定南方电网公司生产技改原则，为今后的技改工作提供指导依据。 2、本技改原则适用于指导公司系统各单位生产技改规划、项目立项申报和审查。 3、各单位可结合本单位实际情况对本原则进行补充和细化，但不得违背本原则的相关条款要求。 4、本技改原则中的相关条款未描述公司、分子的反措要求，但公司、分子公司反措须同样视为生产技改原则。 5、本技改原则中尚未介定的设备的技改原则由各单位自行确定。 6、本技改原则可作为设备技改的立项依据，但不作为唯一依据，满足相应条款的要求后仍需进行论证和评估。 二、术语和定义 1、不具备修复价值：是指一次设备运行10年及以上、二次设备运行5年及以上，经状态评估需要进行大修，但大修费用超过整体换新投资的30％及以上或在技术上难以通过大修恢复其性能使其满足生产实际需要的。 三、设备技改原则 （一）110kV及以上变电站改造原则 1、110kV及以上变电站应逐步实现综合自动化，进行综合自动化改造时非集控站不得设立模拟屏、电视墙等装置。 2、110kV及以下电压等级变电站应按照“无人值班，少人值守”的模式进行改造。 3、对110kV及以上变电站进行数字化改造应按照公司总体规划和计划进行，相关要求如下： （1）目标变电站属于公司试点计划或者推广计划内，且该变电站综合自动化投运12年及以上； （2）数字化改造需基于IEC 61850标准，对现有变电站综合自动化系统进

哺乳动物成熟红细胞的呼吸方式

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 哺乳动物成熟红细胞的呼吸方式 哺乳动物的成熟红细胞结构很特殊，既没有细胞核也无线粒体、核糖体等各种细胞器，却富含血红蛋白，这种结构特点与其运输O2的功能是相适应的。 因为无线粒体，红细胞进行无氧呼吸供能。有些学生对此产生疑问：红细胞本身携带O2，却进行无氧呼吸供能，有O2存在时，其无氧呼吸不会受抑制吗？并列举如下理由：①很多种厌氧型的细菌若生活在空气中，其无氧呼吸受到抑制，不能正常生存。②酵母菌等兼性厌氧型的生物生活在氧气充足的环境中进行有氧呼吸，在缺氧的条件下才进行无氧呼吸。 首先明确并不是所有厌氧型的生物都不能生活在有氧环境中，只有那些严格厌氧菌才不能生活在空气中（如光合细菌，产甲烷杆菌等），而耐氧性厌氧菌是可以生活在空气中的。厌氧菌能否生活在空气中，与其体内是否含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（或过氧化物酶）有关。细胞代谢过程中会产生自由基，自由基是指那些带有奇数电子数的化学物质，它们都带有未配对的自由电子，具有高度的化学活性。在O2存在时还会产生超氧阴离子自由基，它是活性氧的形式之一，性质极不稳定，化学反应能力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。好氧性生物或耐氧性厌氧菌细胞内可合成SOD和过氧化氢酶（或过氧化物酶），超氧阴离子自由基在SOD作用下被歧化成H2O2，在过氧化氢酶作用下H2O2又进一步转变成无毒的H2O，而严格厌氧菌不能合成SOD，在有O2存在时，由于无法歧化超氧阴离子自由基而身受毒害，无法生存。 红细胞内存在这两种酶（红细胞未成熟前已合成），生活在有氧环境中，不会受自由基的危害而抑制其代谢活动。 酵母菌等兼性厌氧型的生物，在缺氧的条件下进行无氧呼吸，当氧气充足时进行有氧呼吸，其无氧呼吸将会受到抑制。为什么在O2充足时，酵母菌的无氧呼吸会受到抑制呢？已知磷酸果糖激酶是无氧呼吸（糖酵解）过程中关键的限速酶，ATP对磷酸果糖激酶具有抑制作用，在有柠檬酸、脂肪酸时会加强抑制效应，而ADP、AMP、无机磷则对此酶有激活作用，酵母菌有氧呼吸会产生较多的ATP，使ATP/ADP比值增高，无机磷相对减少，有

pGL3-Promoter哺乳动物表达载体说明

pGL3-Promoter 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6010 pGL3--‐Promoter pGL3--‐Promoter载体基本信息 载体名称: pGL3-promoter, pGL3promoter 质粒类型: 荧光素酶报告系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: SV40 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5010bp 5' 测序引物及序列: RV primer3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3' 测序引物及序列: GLprimer2: CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: -- 备注: 用于快速定量评估影响哺乳动物细胞特定基因表达的因子及其影响能力。 稳定性: 稳定 组成型: 非组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pGL3--‐Promoter载体质粒图谱和多克隆位点信息

pGL3--‐Promoter载体序列 ORIGIN 1 GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCCGG GCTCGAGATC TGCGATCTGC ATCTCAATTA 61 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC 121 CGCCCATTCT CCGCCCCATC GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC 181 CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG

企业技术改造的原则及问题

当我们成切地跨入21世纪以后，我国的“十五”计划已经公布，不少印刷企业也在设计本企 业的“十五”计划，特别是近五年的技术改造计划。国务院关于《国有大中型企业建立现代企业制度和加强管理基本规范》（以下简称《规范》）也提出了企业进行技术创新，科学地进行技术改造的要求。如何成功地实施技改，提高企业技术创新的能力值得反思。这是企业的大事，是企业的命根子。“不技改是等死，技改是找死”的根本原因是没掌握好技改的科学原则，信息不通，盲目决策，缺乏预见性和系统性，对出现的问题没有正确的对策。凡事“预则立，不预则废”，所以系统性地了解企业技术改造的科学原则及问题的解决方法很有必要，企业的高中层管理人员必须全面掌握，才不会决策失误，操作失当。 一、市场导向原则 市场导向原则，就是指企业技术改造根据市场需要的商品而购买或改造相应的技术设备的技改原则。党的十四届三中全会《决定》指出：现代企业制度的基本特征之一“是企业完全按市场需求组织生产和经营”。《中共中央关于国有企业改革和发展若干重大问题的决定》（以下简称《决定》）也指出：“国有企业技术进步和产业升级的方向与重点是：以市场为导向，用先进技术改造传统产业，围绕增加品种、改进质量、提高效益和扩大出口，加强现有企业的技术改造。”市场经济与计划经济最大的不同是：前者根据市场的需求组织生产，需要什么生产什么，生产跟随需求快速变化；后者是根据上级的计划组织生产，经常出现市场需要的商品没有，市场不需要的商品堆集如山，往往是“计划不如变化快”，产需脱节，几十年一贯制。以市场为导向，首先要考虑市场容量，适销对路，以“双高一优”、专新特为方向调整产业结构，产品升级，提高市场竞争能力和企业核心竞争能力。 全国照排的名牌企业南京理工排校有限公司成功的重要因素之一是他们在铅排占统治 地位的时候，上了市场需要的激光照排，并逐步扩大了照排市场；当其他企业上照排时，他们又上了其他企业没有的校对工序，增加服务功能，赢得了出版社的芳心；更以排校质量、服务质量高出一般企业几倍的业绩吸引、稳住了出版社跳动的心；当外省、外国的出版社需要抢时间、抢速度、减少麻烦时，他们就上网络传版，服务到家。其结果是其他大厂年产量少到一二千万字时，他们却高达3亿多字；多数照排企业做不起亏损时，他们却在上规模、上档灾，欣欣向荣。对比之下，技改是否以市场为导向是何等的重要！ 因市场调查不准，盲目上马，西南某省一个地区就引进了几条凹印生产线，结果是设备闲置的多，经济效益不好。 二、产业导向原则 产业导向原则，就是要符合国家或国际权威机构提出的技术、商品市场发展方向的技改原则。此种导向与计划经济背景下人为下达的指令性计划不同，它是专家学者根据技术、商品市场发展的规律提出的指导方针；如最近我国发布的“双高一优”技改导向书就属此种性质。政府或权威机构产业导向的指导思想是支特先进生产力的发展，淘汰落后生产力，并用政策措施给予保障。如《决定》指出：“对于有市场、有效益、符合国家产业政策的技术改造项

哺乳动物细胞冷冻保存

哺乳动物细胞冷冻保存 主要目的： （1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。 （2）减少细胞被微生物污染的危险性。 （3）减少细胞之间交叉污染的危险性。 （4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。 （5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 （6）降低人力和物力。 冷冻保存要点： （1）冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30－60 分钟；然后转入-20℃，放置30 分钟；然后再转入-80℃放置16－18 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存。 （2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml。 （4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20％。 （5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。 特别注意： （1）细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。 （2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。 （3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。 常用细胞冷冻保存液： （1）10％DMSO ＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液） （2）10％甘油＋完全细胞生长培养液（20％血清＋基础培养液）悬浮细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）取对数生长期细胞培养物，离心200－400g 5 分钟。用粘附（贴壁）细胞冷冻保存操作程序（液氮保存法）： （1）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 （2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到25－30ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养 DMSO。如果，细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。 特别注意：

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ 1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。 2、CHO细胞与293细胞有什么区别？ 答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长， （2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性， （3）能够表达与人相似的翻译后修饰。 此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。 HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什 么？ 答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1), 该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E 细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。 4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？ 答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进 行优化密码子。 蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂 分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。 有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解） 难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

国家电网公司生产设备大修原则

国家电网公司生产设备大修原则 一、编制目的 为实现公司建设?一强三优?的发展目标，以设备可靠性为核心，以资产（设备）评价为基础，落实资产全寿命周期管理要求，提高电网设备（设施）大修项目计划编制的科学性、针对性和规范性，有重点、有步骤解决制约电网安全经济运行的关键问题，依据《国家电网公司设备大修管理办法》，特制定本原则。 二、编制范围 本原则适用于公司总部,各分部以及公司系统各省（自治区、直辖市）电力公司、国网运行公司、国网新源公司等相关直属单位（以下简称?各单位?）。 本原则针对大修对象为生产设备、设施及附属（辅助）设施，主要包括电厂设备、电网一次设备、厂站自动化系统、调度自动化系统、继电保护及安全自动装臵、电力通信系统、自动控制设备、电网（厂）生产建筑物、构筑物等辅助及附属设施、安全技术劳动保护设施、非贸易结算电能计量装臵、监测装臵等。 三、总体原则 1坚持?安全第一、预防为主、综合治理?方针，严格

执行国家、行业、地方有关方针政策、法律、法规，落实公司相关标准、制度、规定和反措要求，重点解决影响电网安全稳定运行的生产设备（设施）问题。 2电网设备（设施）大修应有利于提升电网安全稳定水平，有利于提升设备运行的可靠性，有利于提升电网经济运行水平。 3资产全寿命周期成本最优原则。在保障电网设备安全可靠运行基础上，统筹考虑电网设备的安全、效能、周期成本，最大限度发挥资产效益，实现电网资产全过程闭环管控和资产全寿命周期技术经济最优。 4以设备状态综合评价为基础原则。统筹考虑设备运检环节安全性评价、隐患排查、状态评价、设备故障缺陷状况等因素，以综合评价结果为基础，解决影响人身安全、电网安全和设备安全的突出问题。优先安排评价认定已处于严重状态，对系统安全运行有严重影响，以及判定为有威胁安全运行的严重缺陷的设备。 5以技术进步为先导，推广先进适用技术，提升电网设备健康水平。 四、通用规范性引用文件 规范性引用文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。引用凡是标注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗 摘要 动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。 传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。 研究背景 动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。 流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%～15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。 抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制

重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制 技术评价一般原则 二OO六年十月

目 录 1前言 1 1.1目的和意义 1.2适用范围 1.3局限性 2宿主细胞的选择 1 2.1宿主细胞来源、历史和一般特性 2.1.1宿主细胞来源和历史 2.1.2宿主细胞一般特性 3重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定 2 3.1目的基因来源 3.2表达载体的具体构建步骤 3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选 3.4重组工程细胞的初步鉴定 4重组工程细胞库的建立 3 4.1细胞库建立 4.2建库细胞的管理 5细胞库检定 3 5.1细胞鉴定 5.1.1细胞种属的鉴定 5.1.2致瘤性试验 5.1.3目的基因和表达框架分析 5.1.4表达产物检测 5.2微生物污染检测 5.2.1细菌、真菌和支原体检查 5.2.2病毒因子的检查 5.2.2.1体外试验 5.2.2.2体内试验 5.2.2.3种属特异性病毒的检定

5.2.2.4逆转录病毒的检测 5.2.2.4.1感染性试验 5.2.2.4.2逆转录酶检测 5.2.2.4.3透射电镜检查 6细胞稳定性研究 6 6.1贮存条件下的稳定性 6.2传代/扩增过程中的稳定性 6.2.1基因水平的比较 6.2.2目的产物表达水平的比较 6.2.3细胞自身的稳定性 6.2.4内源因子检查 6.2.5 致瘤性监测 7 生产过程细胞质量控制 7 7.1常规生产过程监控 7.2细胞增殖限度 7.3其它风险性因素控制 8小结 8 9、名词解释 9 10、参考文献 10

1前言 对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成具有预期生物活性的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。 在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/灭活工艺的验证。 1.1目的和意义 经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。 本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。

哺乳动物红细胞专题知识总结

哺乳动物红细胞专题知识总结 生物组赵鹏 高中阶段关于红细胞的知识一再出现，尤其是哺乳动物红细胞，历年各省高考题、全国高考题多次以红细胞为知识背景考查学生的能力水平，由此也凸现了红细胞知识的重要性。在此做以总结，望在同仁中起到抛砖引玉的作用。 一、形态与颜色：双凹型结构、红色。如下图： 二、产生：由骨髓中的造血干细胞分裂、分化形成。其分化的示意图如下： 三、基因突变——镰刀型细胞贫血症： 1、病因：造血干细胞分裂分化形成红细胞的过程中还要不断地分裂形成新的干细胞， 若这个过程发生基因突变，则可能诱发镰刀型细胞贫血症。其示意图如下： 2、概述：是一种隐性基因遗传病。患病者的血液红细胞表现为镰刀状，其携带氧的功能只

有正常红细胞的一半。 3、诊断： （1）细胞水平：取血液制装片，光学显微镜观察红细胞的形态； （2）分子水平：利用β—珠蛋白基因做成的探针进行检测。 典型考题： 例、（07江苏高考生物试卷38题）单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。 （1）从图中可见，该基因突变是由于________引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切点，突变基因上只有2个酶切点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示________条，突变基因显示________条。 （2）DNA或RNA分子探针要用________等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列（---ACGTGTT---），写出作为探针的核糖核苷酸序列________。 （3）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠有胎儿Ⅱ-1～Ⅱ－４中基因型BB个体是____________，Bb的个体是________，bb的个体是_______________。 评析：展示本题的目的不仅在于让学生巩固复习利用探针来诊断疾病的方法，同时让学生了解整个过程的梗概，因为近些年高考题中，有关电泳的考题并不少见，可藉此机会向学生简述。 答案：(1)碱基对改变(或A变成T) 2 1 (2)放射性同位素(或荧光分子等) …UGCACAA…(3)Ⅱ一l和Ⅱ一4 Ⅱ一3 Ⅱ一2 4、治疗：骨髓移植，即向患者移植正常人的造血干细胞。 ○1骨髓库：骨髓库并不是把供者的骨髓或造血干细胞存到库里。骨髓库里保存的只是志愿捐献造血干细胞人们的名字、年龄、性别、健康状况、详细地址、HLA基因检查结果等。如果有一个患者需要做造血干细胞移植，患者的HLA基因与所有志愿者的HLA基因进行配对，配对相合，便通知该志愿者捐献造血干细胞。因此骨髓库参加的志愿者越多，库容量越大，患者找到相合捐献者的机会就越多。 ○2属于器官移植，会产生排斥反应；