绿色荧光蛋白分子标记的研究现状 - 副本(1)

绿色荧光蛋白分子标记的研究现状王枝平赵天垚马胡坚2012311535

摘要近年来, 来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中，来源于水母的绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP) 分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法,对于目前在各个研究领域有很好的应用价值。目前，GFP在微生物降解污染物、环境生态学和环境检测生物等领域取得了很好的应用效果。

关键词绿色荧光蛋白分子标记应用价值

序言近年来，荧光蛋白基因标记技术是迅速发展的一种新型细胞示踪技术。其中，绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是应用最广泛的标记基因，在GFP基因标记后，在特定波长激发下，细胞可以强烈而持久地发出绿色荧光，同时保持良好活性，体内单个荧光细胞亦可用多种方法敏感地检测出来。 GFP是一种良好的标记物, 表达对寄主细胞无毒性作用, 可连续培养。表达后, 能自发产生荧光蛋白, 可借助荧光体视镜和荧光显微镜进行活体实时定位观察。目前, GFP 已被广泛应用到真菌的研究中, 并也取得了前所未有的成果【1-2】。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上, 但是化学计量和染料附着的部位难于控制, 因此尚需再次纯化。正是由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质, 且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光, 使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。

一：绿色荧光蛋白的基本结构与性质

绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)最早是由Shimomure [3]等在1962年时由多管水母中提取而来.后来Prasher 等人在 1992 测得，为 238 个氨基酸残基组成，

分子量约27kDa。其折叠结构为一（高×直径）的β筒状结构，筒状结构两端由一些较短的α螺旋盖住，生色团位于筒状结构中央，生色团完全被包覆，处于β筒状结构内部的氢键网络中，三维结构的形成与生色团的固定以及GFP的荧光有非常紧密的关系:一是保护了生色团免遭分子氧的淬灭；二是防止生色团形成过程中处于激发态的中间体的构象翻转[4]。

二 GFP的生物发光原理

早在六十年代初期, Shimomura 等[3]首先从多管水母属(Aequorea victor ia) 中分离出一种称为 Aequorea 的蛋白, 该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光, 当时称为光蛋白(Photoprotein)。它是分子量为 20kD 的单一多肽链, 在其发光前, 1Mol 的 Aequoria 结合 3Mol的钙离子及 1Mol 非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋白体系本身发射蓝光, 然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色, 推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。Morise等[4]对 GFP 进行了分离和纯化, 他们的实验结果表明, GFP 的荧光发射峰在 509nm, 最大激发波长为 395nm, 并在 475nm 处有一肩峰。当将 Ca 2+加入到含低浓度 GFP 的 Aequorin 溶液中时, 光谱接近于Aequorin 发射的蓝光( K max472nm); 而将 Aequorin 和GFP 按大自然比例混合时, 加入Ca2+, 则光谱接近于活体的发射光(K max 509nm)。推测在活体内, GFP 通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程, 吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光[5]。

总的说来，Shimomura在发现GFP中作出了重要的贡献，如对其纯化和物理化学表征等方面,以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等.他们说明了GFP可以作为一种能量受体以及Aequorin作为能量给体,而在二者间发生了Forster的能量转移,并解释了由GFP发射的是绿光而不是蓝光.他们还正确的指认了与GFP多肽链体的发色团的不同功能部分.而如果没有这些Shimomura开创性的经典工作,有关GFP的出现和广泛应用将推迟几十年,甚至至今它仍作为

一种秘密保留在太平洋中[111]。

三: 绿色荧光蛋白分子标记技术

由于绿色荧光蛋白分子受到蓝光照射时会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，作为一种新型的报告基因。

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重GFP标记的微管组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。而且GFP 的荧光产生不需要任何水母中特别组分的参与，蛋白质序列本身已经包含了GFP 发光所需的信息[5，6]。Tsien[7]等人表明生色团的形成不需要任何酶或辅助因子的参与，而只需氧分子的存在。GFP 在DNA 内至少都有 3 个启动子。将其与目的基因结合后，对宿主细胞的功能结构基本无影响及毒副作用。当其在细胞内得到表达后，在蓝光的照射下，可以发出荧光，并借助荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜即可对活细胞进行实时定位观察，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1994 年，Chalfie 等人[5]首次在原核的大肠杆菌中表达了具有荧光性的 GFP，Inouye 和 Tsuji[6]则在秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的 GFP。

四：GFP 基因的改进

绿色荧光蛋白作为分子探针有很多优越性，但还是有局限性，如绿色荧光蛋白质的折叠会被温度影响，激发峰强度比较小，可以会不易被监测到，科学家通过野生型 avGFP 的随机突变和定点突变得到了让荧光更加稳定及明亮、温度敏感性及溶解性得到明显改善的突变体，甚至还可以得到别的颜色的荧光蛋白，扩大其的应用范围。突变体的获得主要有以下几种[8]：1.去除掉基因中的隐蔽的内含子；2.改变某些碱基的组成； 3.将绿色荧光蛋白的生色团氨基酸进行替换；4 .插入植物性的内含子； 5 .替换为较强的启动子。常见的 GFP 突变体有[8]：（1）增强型 ,GFP（2）人工 GFP，（3）蓝色荧光蛋白,（4）红移荧光蛋白。

总的来说，绿色荧光蛋白标记法对现在起着很大的作用，但对于提取液和提取的物质是绿色的样品可能会出现一定的影响。此时，我们还可以用其他颜色的标记法来验证。在进行标记的时候，我们还应该考虑到是否还有其他生色团在起作用，在实验之前我们要尽量避免。

五：绿色荧光蛋白分子标记技术应用

绿色荧光蛋白作为最有效的活细胞标记物质，目前已经广泛应用于基因表达标记及调控、蛋白质定位、胚胎发育、分子生物学、生物传感器、生物探针和生物成像等领域。绿色荧光蛋白(GFP)可直接进行活体观察, 它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。贾洪革等[9]借助 GFP荧光的消失, 快速选出 nptII 被消除的二次转化体，成功的利用绿色荧光蛋白监测转基因植

物中选择标记基因的消除。高苒[10]等利用绿色荧光小鼠和红色荧光 RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互。

六：结束语

绿色荧光蛋白分子标记技术已经广泛用于各个领域,宏观领域上,可研究病原菌的防效,微观领域上,可研究蛋白质功能、细胞亚结构、病原菌与寄主的关系、基因表达等。绿色荧光蛋白不仅运用在微生物、植物等范围，还运用在人类身体里有些器官的研究。绿色荧光蛋白分子标记法对科研者研究各方面都起着不可替代的作用。同时，我们可以看到:他们所获得的有着其深厚的科学背景,正是由于有大量科学工作者对这一重要科学现象持续不断的兴趣和从各个方面所做的不懈努力,从而积累起广泛而深厚的基础,方能在今天,使我们对这一问题能有较深入了解,以及作为其中的杰出代表人物能获此殊荣.这正如牛顿所说的:“我之所以看得比别人更远些,是因为我是站在巨人的肩上”.因此看来,要真正认识宇宙的奥秘,使国人在世界科学研究中有更大的贡献,广泛科学水平的提高是不容忽视的。

[1] 徐莹, 刘太国, 何月秋, 等. 绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用[ J] . 植物保护, 2008, 34( 6) : 1 -6.

[2] 徐进, 莫明和, 张克勤. 绿色荧光蛋白GFP 在真菌研究中的应用[ J] . 生物技术, 2004, 14( 6) : 74 -77.

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[3]Shimomura O. Structure of the chromophone of Aequorea green fluorescent protein[J] FEBS Letters,1979,104:220-222

[4]王建国。绿色荧光蛋白生色团的荧光增强及其在细胞成像中的应用。

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[9]1 吕玲飞,庞永奇,陈晓英,方荣祥.用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除[J]生物工程学报.2004 .1:11-15.

[10]高苒, 刘学丽, 冯娟, 张连峰.荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用[j].中国比较医学杂志2008 .5 （18）60-65.

[111] 吴世康绿色荧光蛋白质(GFP)的发现、表达和发展第27卷第1期影像科学与光化学Vol.27 No.1 2009年1月,69-78.

荧光蛋白(整理)

荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP ）

在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb 。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基（Ser65-Tyr66-Gly67 ）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching ），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （3）野生型 野生型GFP（wild type GFP, wtGFP ）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP （EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 （5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP） 为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 （6）增强型黄色荧光蛋白（EYFP）另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白（EYFP），该变体有四个氨基酸突变。在527nm时，EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感，使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用

绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总

学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月

目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析 姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学 摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。 关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有

效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要： 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词：绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言： 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）一支，pETH/DH 5α(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果） 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100μl+100μl水），正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数

绿色荧光蛋白的研究现状与应用

绿色荧光蛋白的研究现状与应用 【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 1 绿色荧光蛋白的理论研究 1.1绿色荧光蛋白的发现 绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 1.3绿色荧光蛋白的优点 绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 2 绿色荧光蛋白的应用 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP 应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 2.1作为报告基因 GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，

绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用_吴沛桥

■通信作者　E mail :baxiaoge1957@yahoo .com .cn 绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用 吴沛桥1 ,巴晓革 2■ ,胡海1,赵静 1 (1.南京农业大学生命科学学院,南京210095;2.山东药品食品职业学院,威海264210) 摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP ),是一种极具应用潜力的标记物,有着 极其广泛的应用前景。我们就GFP 的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。 关键词:绿色荧光蛋白(GFP );标记物;荧光特性;进展;改进;应用 中图分类号:Q51,503;R318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278(2009)01-0083-04 Research Progress and Application of Green Fluorescent Protein WU Peiqiao 1 ,BA Xiaoge 2 ,HU Hai 1 ,ZHAO Jing 1 (1.Nanjing Agricultu ral University ,College of Life Science ,Nanj ing 210095,China ; 2.Shandong Drug and Food V ocatio nal College ,W eihai 264210,China ) A bstract :The green fluorescent protein (GFP )from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker ,has a wide range of applications .The article on the physical and chemical properties ,the fluorescence characteristics ,improvement and application of GFP are reviewed . Key words :Green fluorescent protein ;Marker ;Fluorescence characteristics ;Progress ;Improvement ;Application 1　引　言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Green fluorescent pr otein ,GFP )是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura 等 [1] 首先从多管水母(Ae quoria victoria ) 中分离出一种分子量为20kD 的称为A equorin 的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP ,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae )和海紫罗兰科(Renillidae )的GFP ,即 Ae quoria GFP 和Renilla GFP 。 2　GFP 的理化性质,荧光特性及其改进 2.1　GFP 的理化性质 从水母体内分离到的GFP 基因,长达2.6kD ,由 3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。GFP 本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。A equoria GFP 分子量约27×103 ,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。两种GFP 有不同的激发光谱,A equoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm ;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。两种GFP 含有相同的 生色团,发射光谱基本相同(λmax =508～509nm )。 GFP 性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH <4.0或pH >12.0的条件下用6mol L 盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是,它们在很大的pH 范围内(pH7～12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP 的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。根据Sheen 生物医学工程研究 J ournal of Biomedical Engineering Res earch 2009,28(1):83～86

绿色萤光蛋白

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。标记细胞 GFP的分子结构和发光机制 绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链，GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其荧光发射峰在509nm。GFP 的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。 Yang等的研究表明，GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体，β-桶状结构直径约3nm，高约4nm。β折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带。桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。 GFP的生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射，此模型为Yang等的晶体学证据所支持。 GFP在生物技术中的应用研究 1．分子标记 作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。 除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。 2．药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段

绿色荧光蛋白的研究

绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用 吴琦 四川农业大学 二○○九年十二月

2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962 年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面公认的先驱。马丁·沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域 。

1962年Shimomure 等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria )中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。绿色荧光蛋白的研究史 维多利亚水母 (Aequorea Victoria)

A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.

绿色荧光蛋白的研究史 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP 的一级结构。

绿色荧光蛋白的研究史 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。

绿色荧光蛋白及其应用

DOI：CNKI:50-1068/S.20120208.1744.051 网络出版时间：2012-02-08 17:44 网络出版地址：https://www.sodocs.net/doc/f414308018.html,/kcms/detail/50.1068.S.20120208.1744.051.html 绿色荧光蛋白及其应用 四川攀枝花学院生物与化学工程学院韩洪波 摘要：作为一种报告基因，由于其自身独特的发光机制，GFP在分子生物学的研 究中得到越来越广泛深入的应用，如用于特定蛋白的标记定位，活体内的肿瘤检 测、药物筛选等等。GFP的运用，为传统生物学研究提供了新思路和新方法。 关键词：绿色荧光蛋白；性质；应用 1962年，Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequorea victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白（aequorin），并观察到一个在紫外光下发出非常 明亮，浅绿色荧光的副产物。[1]1974年，Shimomura等纯化得到了这种自发荧光 的蛋白。1985年Prasher 等构建维多利亚多管水母的cDNA文库，用于克隆水 母蛋白的编码基因，并得到含有GFP片段的蛋白。[2]1992年Prasher 等克隆到 编码全长GFP 的cDNA但直到此时人们对GFP的应用前景还不甚了解。1994 年，Chalfie 等首次在原核的大肠杆菌和真核的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达了具有荧光性GFP，证明GFP 的荧光产生不需要水母中特异组 分的参与，钱永健及其同事提出GFP中Ser65-Tyr66-Gly67 氨基酸残基形成4- 对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮生色团发光的机制，并表明生色团的形成不需要任何 酶或辅助因子的参与，而只需分子氧的存在此后对GFP的研究进入了高潮，并 在1996 年解析了其晶体结构基于已有知识和晶体结构，人们通过突变的方法得 到许多不同荧光性质的GFP同时，受GFP启发，人们开始在其它生物中寻找类 似的荧光蛋白，并相继在珊瑚、海葵、水螅甲壳类动物甚至低等脊索动物中发现 了GFP样蛋白荧光谱覆盖蓝色到远红光，使得荧光蛋白的使用范围不断扩大， 极大地促进了生命科学和医药科学的发展。2008年，诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura，MartinChalfie 和Roger Tsien以表彰他们因发现和发展了绿色荧光 蛋白所做的巨大贡献。[3] 一、GFP的分子结构和发光机制

试验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 ——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095） 一、引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。 基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果 二、主要路线： 1、质粒DNA的提取 2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 3、酶切连接重组质粒 4、重组质粒的扩增 5、菌落PCR法鉴定阳性克隆 6、目的荧光蛋白基因的表达 1、质粒DNA的提取 实验原理： 1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞

绿色荧光蛋白研究进展

动物医学进展,2008,29(1):56259 Progress in Veterinary Medicine 绿色荧光蛋白研究进展 王晓丽1,邵卫星2,单　虎13 (1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266071) 摘　要:来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。 关键词:绿色荧光蛋白;选择标记基因;应用 中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120056204 随着生命科学和医学研究的不断深入,研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因,目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline p ho sp hatase, SEA P)基因、β2半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β2葡糖苷酸酶(glucosidase,GU S)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase,L UC)基因等[1],但这些基因的检测方法并不理想,它们都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。一种全新的非酶性报告基因———绿色荧光蛋白(green fluorescent p rotein, GFP)引起了人们的关注[2],该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。作为报告基因,GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白;作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率, 收稿日期:2007210218 作者简介:王晓丽(1981-),女,山东威海人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。3通讯作者 [19]　Mammina C,Pontello M,Dal Vecchio A,et al.Identigica2 tion of Shigella sonnei biotype g isolates carrying class2inte2 grons in Italy(200122003)[J].J Clin Mirobiol,2005,43: 246722470.[20]　Mammina C,Aloe A,Romani C,et al.Shigella sonnei bio2 type G carrying class2integrons in sout hern Italy:a retro2 spective typing study by pulsed gield gel electrophoresis[J]. BMC Infect Dis,2006,(6):117. Advance in G ene C assett2Integron System of B acteria WEI Shu2yong1,WU Deng2hong1,L IU Shi2dong2 (1.V eterinary Depart ment,S out hwestern Uni versit y Rongchang Cam pus,Chongqing,402460,China; 2.Forest Enterp rise of L inyi,L inyi,S handong,276000,Chi na) Abstract:Gene cassette is a minor2movable deoxyribonucleic acid(DNA)molecule,and usually is t ran2 scribed wit h a integro n.Integron is a conservative and movable transposon2like DNA element,which can make a horizontal transmission of drug resistance gene and has a great cont ribution on t he diff usion of drug resistance gene among bacteria and t he production of multidrug resistance.Since t he concept of gene cas2 sette and integro was p roduced,new types of integron was detected continuously.At p resent,t hree types of integron were generally accepted and named typeⅠ,typeⅡand typeⅢ.TypeⅠintegron has a more de2 tection and deep research.This article summarizesd t he origin,st ruct ure,categorization,expression,bio2 logical detection and t he relationship between bacterial drug resistance and t he recent advance in gene cas2 sett2integron system of bacteria. K ey w ords:gene cassette;integro;drug resistance

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

石河子大学 分子生物学实验结课论文 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种