山楂核中熊果酸含量的HPLC测定
山楂核中熊果酸含量的HPLC 测定
杨晓彤 程乐乐 糜 可 周韵丽 杨庆尧
上海师范大学微生物与免疫学研究所 (上海 200024)
摘要:采用C 18反相高效液相色谱RP -HPLC 法对山楂核中的熊果酸作含量测定。结果:测得山楂核中的熊果酸含量为01577mg/g,回收率为103113%,保留时间和峰面积的变异系数分别为0118%和1168%(n =8)。山楂核甲醇萃取液在作HPLC 分析前,先用硅胶柱吸附,再用洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,可去除大部分杂质,提高测定效果。
关键词:山楂核(Seed of Crataegus pinnati fida ),熊果酸,RP-HPLC 中图分类号:R 282.6 文献标识码:B 文章编号:1008-861X(2001)01-0055-03
基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(96011)
熊果酸(Ursolic acid,UA )属三萜类化合物,广泛存在于山楂、乌梅、夏枯草等植物[1]。近年发现熊果酸除有抗炎、抗突变活性外,对多种恶性肿瘤细胞亦有强烈的毒杀效应[2~4],并有诱导癌细胞分化的能力[5]。已知山楂中含熊果酸[6]。有人在山楂核中也检测到熊果酸[7],但迄今未见其含量报道。本文用HPLC 测定了山楂核中的熊果酸含量。1 仪器与材料
仪器:Beckman Gold System 高效液相色谱仪及软件,125型泵,168型紫外二极管阵列检测器;Beckman Ultrasphere C18反相柱(416@250mm,加416@50mm 保护柱);旋转蒸发器为B chi 公司产品;C Q250超声波发生器产自上海超声仪器厂。 材料:熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供。山楂购自天津市场,品种名:大红袍。测定用甲醇为色谱级。提取用试剂(甲醇、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸)均为化学纯。层析硅胶为上海五四化学试剂厂产品。2 方法与结果
2.1 山楂核样品制备、预处理及熊果酸检出
2.1.1 样品提取: 将鲜山楂沸水煮1min 后,分离山楂核,60~80e 烘干,打成200目的细粉,精密称取山楂核粉1g,加100ml 甲醇,90e 水浴回流提取6h 或置超声波发生器内超声提取1h,过滤,取滤液减压蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5ml,待作硅胶柱预处理。
2.1.2 硅胶柱预处理: 取100g 层析用硅胶,用二倍柱体积的洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1,V/V)洗脱,100e 烘至无酸味。取118g 装成id 8@85mm 的硅胶柱。精密吸取015ml 待处理样品于硅胶柱上,待甲醇挥干后用7ml
层析液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,收集洗脱液,减压蒸干,用甲醇溶解并定容至1ml,0122mm 膜过滤后进行HPLC 分析。
2.1.3 样品测定结果 山楂核提取样品经硅胶柱预处理后上HPLC 仪测定,测定用流动相为甲醇/水(用甲酸调p H 至3)=95/5(V/V);流速:1ml/min;进样量:20L l;在215nm 波长下检测,用熊果酸标准品作对照。结果:样品在熊果酸标准品的出峰位置上出现相同的色谱峰(图1)。另在样品中加入熊果酸标准品后该峰的面积增加,但保留时间未改变,且没有出现新增的峰(图2)
。
a:山楂核甲醇提取物 b:熊果酸
Me than ol extract of the Ursolic acid(uA)S eeds of C.pinnati fida
图1 山楂核甲醇提取物与熊果酸标准品HP LC 色谱图
Fig.1 HPLC ch romatograms of m eth an ol extract of the seeds of C.pinnati fida
除上述色谱图外,另以每秒4次的频率记录190~320nm 范围内的光谱吸收,结果两者的光谱吸收图完全一致,其最大吸收在204nm(图3a)。将上述光谱进一步作二阶导数变换,其二阶导数光谱也完全一致(图3b)。由此可见两者为同一物质,山楂核提取物中的该色谱峰为熊果酸吸收峰。
第15卷第1期2001年3月
上海中医药大学学报
ACT A UNI VERSIT ATIS TRADI TIONIS MEDIC AL IS SINENSIS P HARMACOL OGIAEQUE S HANGHAI
VOL.15NO.1
Ma r.,2001
a:未加熊果酸标准品 b:已加熊果酸标准品Not UA added
UA is added
图2 样品中加入熊果酸标准品前后的HPLC 色谱图
Fig.2Chromatograms of HP LC before and after UA is added to the sam
ple
a:紫外吸收光谱 b:紫外吸收光谱的二阶导数光谱UV spectrogram S econd derivative spectrogram of UV 图3 山楂籽中熊果酸与标准品的紫外吸收光谱及其二阶导数光谱
Fig.3 S pectrograms of UV and second derivative of UA and seeds of C.pinnati fida
2.1.4 样品预处理效果 比较样品经硅胶柱预处理前后的HPLC 图,结果见图4
。
a:未经预处理 b:经预处理
Before pre-treatment After pre-treatment 图4 样品经硅胶柱预处理前后HPLC 色谱图
Fig.4 HPLC chromatograms of the silica g el column before and after the pre-treatment of samples
2.2 山楂核中熊果酸含量的HPLC 测定
2.2.1 标准曲线制作 精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品9171mg,甲醇溶解成浓度为01971mg/ml 的标准溶液。精密吸取该溶液,加甲醇配制成浓度分别为01194,01097,01049,01024,01012(mg/ml)的溶液进行HPLC 测定,并计算回归方程。结果熊果酸峰面积(P.A.)与熊果酸浓度(Conc.)关系为:P.A.=12411465Conc.)
01305649(r=019998)。
2.2.2 精密度测定 取熊果酸标准溶液(浓度为011942mg/ml)连续进样8次,结果见表1。表1
精密度测定结果
Tab.1 Res ult of precision determination
Inj ection ti me
RT (min)Peak area 191285021188252912490221042139125802116051491239021112035912700211775369125802214042791280021170928
9124702118517 x ?s 912608?010163
2117988?013668
CV (%)
01176
11680
2.2.3 提取方法比较及山楂核中熊果酸含量的测定:分别用甲醇回流和甲醇超声提取三份山楂核样品,经硅胶柱预处理后进行HPLC 分析,分析条件同2.1.3。结果见表2。表2 两种提取方法所得山楂核中熊果酸量的比较(mg/g)
Tab.2 Comparis on of contents of UA of seeds of C.pinnati fida by two extraction methods
Sample Reflux extrac t Ultras onic extract
101577015042016020156930155101597 x ?s 01577?01003
01557?01005*
CV(%)
4141
8150
Compared with Reflux extract *P >0105
2.2.4 回收率测定:精密称取3份山楂核粉,每份1g,每个样品均平行测定2次,然后再在样品中各加入熊果酸标准品011942mg,结果见表3。
54实验研究
表3回收率
Tab.3Recovery rate
Sample Contents of UA in sample UA added Detect content Recovery rate Average CV(%) 1015770119401779101101
20160201194018251031661031131185 3015510119401780104171
3讨论
3.1熊果酸甲醇溶液经紫外吸收光谱扫描,其最大吸收波长为204n m,但甲醇在此波长下亦有很强的背景吸收,为减少干扰,我们按郝氏的建议[8],选择215n m作为熊果酸的检测波长。测得的熊果酸最大吸收波长为204nm,与赵氏[9]报道基本一致,但与郝氏[8]报道有较大差异。其原因可能是彼此选用的液动相极性和p H差异的缘故。对两种提取方法的比较,超声提取1h的熊果酸提取量与回流提取6h的提取量相当,提取速度超声法远比回流法快,但超声提取的变异系数高于回流提取法(表2)。所测得山楂核中的熊果酸平均含量为01577mg/g,低于文献报道的山楂果肉中的熊果酸含量[8],但高于国外从高山植物蔓九节(Psychotria se rpens)中提取的熊果酸量[10]。山楂核系废弃物,从山楂核中提取熊果酸,为山楂核利用提供了新途径。
3.2样品中的杂质在作HPLC分析时,会对结果产生严重干扰,甚至会导致分析柱失效。有人提出先用石油醚浸泡的方法作预处理以减少杂质[9],但残渣经石油醚浸泡后容易松动脱落,造成熊果酸的损失。我们用硅胶柱作预处理,既不丢失熊果酸,杂质含量又大大减少,保证了测定的准确性。3.3对山楂核提取物作测定时发现,在熊果酸峰前另有一小峰,经与齐墩果酸标准品在相同条件下对比,两相重叠。推测山楂核中另存在着少量的齐墩果酸,这与山楂的分析结果相似,山楂中除含熊果酸外,亦含少量齐墩果酸[7][9]。
参考文献:
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编辑:黄健
修回日期:2000-12-19 Determination of Ursolic Acid C ontent in Seeds of Crataegus Pinnatifida by HPLC
YANG Xiao-tong,C HE NG Le-le,MI Ke,ZHOU Yun -li,YANG Qing-yao
Institute o f Microbiology and Immunolo gy,Shanghai Teachers University
ABSTRACT:The content of ursolic acid in the seeds of Cratae gus pinnati f ida was determined by C18reverse phase high performance liq uid chromatography.By methanol:water(95B5)as a mobile phase and under215mm wave length,the content of ursolic acid deter-mined in each gram of the seeds of Crataegus pinnati f ida was 01577mg and the recovery rate was103113%.The varian t coeff-i cient of the retention time and peak area was respectively0118% and1168%(n=8)in a good precision.Before HPLC analysis, methanol seed extracts were purified on silica gel columns and then eluted wi th an eluting fluid(cyclohexane B ethyl acetate B acetic acid= 12B4B1)to remove most impurities and enhance the determining ef-fect.
KEY WORDS:Seeds of Crataegus p innati f ida,ursolic acid,re-verse phase HPLC
55
实验研究
熊果酸含量测定方法研究进展
熊果酸含量测定方法研究进展 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】熊果酸；含量测定方法 熊果酸（ursolie acid，UA）又名乌索酸、乌苏酸，属于三萜类化合物，广泛存在于熊果、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中，具有抗炎、护肝、降血脂等多种生物学活性［1～4］。目前许多中药材及其制剂常选用熊果酸的含量作为其质量控制指标。本文对熊果酸含量测定方法的研究进展综述如下。 1 分光光度法 李国章等［5］建立了湘产3种苦丁茶中熊果酸含量测定的分光光度法，具体操作是取苦丁茶经索氏提取器提取后，加入5%香草醛－冰醋酸、高氯酸显色，在波长548 nm处测定吸光度，结果熊果酸在4～20 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好，加样回收率为98.96%。罗启剑等［6］采用同样方法测定了连钱草中熊果酸含量，结果熊果酸在0～18 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好，加样回收率为100.64%。 2 薄层扫描法
白洁等［7］采用双波长薄层扫描法测定了夏枯草中熊果酸的含量，具体操作为取夏枯草药材粗粉经95％乙醇超声提取两次，滤液用70℃水浴蒸干，残渣用石油醚浸泡两次，挥干溶剂，用95％乙醇溶解后测定。采用硅胶G板，以环己烷－氯仿－醋酸乙酯（20∶5∶8）为展开剂，用10％硫酸乙醇溶液显色，选用λS=540 nm，λR=700 nm进行双波长反射式锯齿扫描，结果熊果酸在0.314～1.570 μg范围内线性关系良好，加样回收率为99.3％。张军等［8］建立了狼疮静颗粒中熊果酸的薄层扫描法测定方法，具体操作为取狼疮静颗粒用乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液水浴蒸干乙醚，残留物加无水乙醇－氯仿（3∶2）混合液溶解后测定，以环己烷－氯仿－醋酸乙酯－甲酸（20∶5∶8）为展开剂，用10％的硫酸乙醇液显色，以λS=520 nm，λR=700 nm进行双波长薄层扫描，结果熊果酸在0.498～3.084 μg范围内线性关系良好，加样回收率为97.91％。 3 高效液相色谱法 3.1 HPLC－UV法戚志华等［9］采用HPLC法测定了陕西女贞子中熊果酸的含量，其方法为取女贞子粉末经超声提取后采用HPLC法，选用Lichrospher C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈－甲醇－水－磷酸－三乙胺（50∶30∶20∶0.02∶0．04），流速1 ml·min-1，测定波长为205 nm，结果熊果酸在20.48～102.4 μg范围内线性关系良好，加样回收率为100.6％。梁洁等［10］采用HPLC法测定了广西产美味猕猴桃根中熊果酸的含量，具体操作为取
熊果酸的含量测定
微波-超声辅助协同萃取-高效液相色谱法测定 新疆野蔷薇根中总皂苷的含量 其买古丽·阿沙木，努尔皮达·阿卜拉江，迪丽努尔·马里克*（新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐840054） 摘要：建立了用微波-超声辅助提取，高效液相色谱测定野蔷薇根中总皂苷的方法，以野蔷薇根总皂苷含量为考察标准，研究了提取时间、乙醇浓度、微波-超声功率、料液比这四个因素对总皂苷含量的影响。该方法线性范围宽，检测限为0.3μg/L，平均相对标准偏差2.2%，加标回收率在99~104%之间。结果表明，该方法的灵敏度高并且具有较好的重复性、准确性及稳定性。 关键词：野蔷薇根；总皂苷；超声；微波；HPLC法。 Determination of total saponins in Rosa multiflora Thunb by Microwave-ultrasonic assisted extraction -high performance liquid chromatography (HPLC) QIMANGUL·Hasan，NURPIDA·Ablajan，DILNUR·Malik (School of chemistry and chemical engineering xin jiang normol university，Urumqi 830054）Abstract： A microwave-ultrasonic assisted extraction-high performance liquid chromatography(HPLC) method for the determination of total saponins in Rosa multiflora Thunb was established ，Regarding the content of total saponins in Rosa multiflora Thunb as the index of investigation, the factors such as the extraction time, ethanol concentration, power of microwave, ratio of solid to liqud as affecting the content of total saponins were studied.Under the optimum extraction conditions,the method yields a good linearity and the low limits of detection are 0.3 μg/L.The recovery was between 99%～104% with relative standard deviation was2.2% . The results shown that the method has Good Repeatability, sensitivity ,stability and accuracy. Keywords: Rosa multiflora Thub; Total saponins; Ultrasonic; Microwave; HPLC 野蔷薇（Rosa multiflora Thub）属于蔷薇科蔷薇属植物，野蔷薇富含多种人体所需的营养物质[1-2]，有较大开发利用价值，现代研究证明，野蔷薇中含有熊果酸、齐墩果酸等三萜类化合物[3]。三萜类化合物是自然界中一类重要化合物，*基金项目：国家自然科学基金（21165018）项目资助 作者简介：其买古丽，女，（维吾尔族）硕士研究生，主要从事天然产物的研究。 联系作者：迪丽努尔.马里克（1964-），女，教授，主要从事天然产物研究。（pkudilnur@https://www.sodocs.net/doc/f93500621.html,）
熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展
Studies in Synthetic Chemistry 合成化学研究, 2016, 4(3), 19-27 Published Online September 2016 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/f93500621.html,/journal/ssc https://www.sodocs.net/doc/f93500621.html,/10.12677/ssc.2016.43003 文章引用: 孟艳秋, 杨丽娜, 潘洪双, 于婷婷, 张伟晨, 宁梓廷. 熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展[J]. 合成化学研究, Research Progress on Antitumor Action Mechanism of Ursolic Acid Yanqiu Meng, Lina Yang, Hongshuang Pan, Tingting Yu, Weichen Zhang, Ziting Ning Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang Liaoning Received: Oct. 1st , 2016; accepted: Oct. 16th , 2016; published: Oct. 21st , 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.sodocs.net/doc/f93500621.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Ursolic Acid is a type of pentacyclic triterpene compounds with many kinds of pharmacological ac-tivities, especially its antitumor activity. The antitumor mechanism of ursolic acid is multifaceted. In this paper, the research progress of anti-tumor mechanism of ursolic acid has been reviewed and forecasted. Keywords Ursolic Acid, Antitumor, Action Mechanism 熊果酸抗肿瘤作用机制的研究进展 孟艳秋，杨丽娜，潘洪双，于婷婷，张伟晨，宁梓廷 沈阳化工大学，辽宁 沈阳 收稿日期：2016年10月1日；录用日期：2016年10月16日；发布日期：2016年10月21日 摘 要 熊果酸是一种具有多种药理活性的五环三萜类化合物，其抗肿瘤活性尤为显著。熊果酸的抗肿瘤机制是多方面的。本文对熊果酸的抗肿瘤作用机制的研究进展进行综述并进行展望。 Open Access
熊果酸药理作用研究进展
熊果酸药理作用研究进展 ，相对分子量456 科植物毛子草的地上部分熊果酸具有广泛的 之 对致癌、促癌物有抵抗作用 多研究认为，熊果酸能通过化学预防、抗突变、细胞生长抑制和细胞毒等作用来抑制 到预防恶性肿瘤的目的。癌的发生、发展一般要经历始发突变、促癌和演变三阶段，干扰三个阶段即可达到延缓或阻止
显增加，部分细胞在
熊果酸在自然界中分布广泛，资源丰富，具有化学预防，保肝、抗肝炎，抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种药理活性，熊果酸药用开发景已被众多研究机构所重视，有望成为一种高效低毒的多用途新药。 【参考文献】 1 李开泉，陈武，熊筱娟，等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展.中成药，2002， 2 4（9）:709-711. 2 Muto Y，Ninomiya M，Fujiki H.Present status of research on cancer chemopre vention in Japan.Jpn J Clin Oncol，1990，20（3）:219-221. 3 黄镜，孙燕.熊果酸的抗肿瘤活性.中国新药杂志，1997，6（2）:101-104. 4 Niikawa M，Hayashi H，Sato T，et al.Isolation of substances from glossy prive t（Ligustrum lucidum Ait）inhibiting the mutagenicity of benzo（α）preene in bacteri a.Mutat Res，1993，319（1）:1-4. 5 Young HS，Chung HY，Lee CK，et al.Ursolic acid inhibits aflatoxin B1-induced mutagenicity in a Salmonella assay system.Biol Pharm Bull，1994，17（7）:990-99 3. 6 Huang MT，Ho CT，Wang ZY，et al.Inhibition of skin tumorigenesis by rosema ry and its constituents carnosol and ursolic acid.Cancer Res，1994，54（3）:701-70 5. 7 Ohigashi H，Takamura H，Koshimizu K，et al.Search for possible an-titumor p romoters by inhibition of12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate-induced Epstein-Barr v irus activation;ursolic acid and oleannolic acid from an anti-inflammatory Chinese m edicnal plant，Glechoma hederaceae L.Cancer Lett，1986，30（2）:143-148. 8 Ames BN.Dietary carcinogens and anticarcinogens.Science，1983，221:1256-12 58. 9 Balanehru S，Nagarajan B.Protective effect of oleanolic acid and urso-lic acid against lipid peroxidation.Biochem Int，1991，24（5）:981-984.
熊果酸的功效与作用
熊果酸是由天然植物中的一种三萜类化合物而来，具特殊的气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。那么熊果酸具体有哪些的作用与功效呢？下边不妨一起来简单了解一下吧。 一、熊果酸的作用及功效 据临床医学表示，熊果酸中有的有益分子，非常显著而迅速的可以降低谷丙转氨酶、血清转氨酶等，对于消退小儿黄疽以及增进食欲等方面都有很好的促进，而对于抗纤维化和恢复肝功能症状，效果也非常的明显，而且还特别的稳定。熊果酸还具备有非常明显的抗氧化功效，这也使得它成为医药及化妆品方面的常备原料，例如医药方面对于肝部的治疗非常有益，能够保护并稳定稳定肝细胞膜、细胞器，从而使输出、运输等功能相继慢慢的恢复，在化妆品方面，由于熊果酸有很好的抗氧化作用，能使肌肤具有抵抗力，与此同时还有效淡化皱纹、修肌肤等皮肤难题。且熊果酸其实还是一味天然的保湿剂，大病可以调理，小病可以医治，又给人们带来不少的惊喜。
二、含量测定标准 1、色谱条件： 硅胶G薄层板;环己烷-氯仿-乙酸乙酯(20:5:8)为展开剂，上行展开;展距12～18cm;5%硫酸乙醇溶液，110℃加热5min显色。 2、样品溶液的制备： 精密称取栀子粉碎样品20g (炒栀子按得率折合后称取)，置索氏提取器内，加乙醚300ml回流提取至无色，回收溶剂至干，残留物加石油醚浸泡2次，每次15ml，约浸泡2min，倾去石油醚，用无水乙醇-乙醚(2：3)混合液微热使溶解并定容于5ml量瓶中，作为样品溶液。 3、对照品溶液的配制： 精密称取熊果酸对照品适量，加无水乙醇：乙醇(3：2)的混合溶液制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品溶液。 4、测定： 准确吸取样品溶液及对照品溶液2μl，点于同一薄层板上。按上述色谱条件展开，显色。照薄层扫描法扫描，λS=520nm，λR=700nm;双波长反射法锯齿
熊果酸
打开的谱图文件：D:\10\熊果酸标准品3(00001).hw ───────────────────────────序号 保留时间 名称 峰面积% 峰面积 ─────────────────────────── 1 0.20 2 0.00464 3 118 2 0.23 3 0.001742 44 3 0.278 0.002292 58 4 0.444 0.009194 233 5 0.652 0.006404 163 6 0.922 0.006128 156 7 1.150 0.005266 134 8 1.199 0.002263 57 9 1.236 0.002975 76 10 1.453 0.009436 240 11 1.652 0.0075 190 12 1.803 0.001693 43 13 2.070 1.414 35901 14 2.659 0.09665 2454 15 2.777 0.1092 2773 16 3.084 1.454 36908 17 3.726 1.346 34185 18 4.277 0.2177 5529 19 4.675 0.4557 11571 20 4.886 0.322 8176 21 5.498 93.84 2382895 22 7.284 0.02985 758 23 7.588 0.006965 177 24 7.853 0.003855 98 25 8.058 0.01011 257 26 8.294 0.0007985 20 27 8.404 0.002138 54 28 8.594 0.00232 59 29 8.920 0.006411 163 30 9.097 0.003013 77 31 9.357 0.005584 142
山楂含片中熊果酸的含量测定
山楂含片中熊果酸的含量测定 目的建立山楂片中熊果酸的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定熊果酸。色谱柱：phenomenex Kinete x2.6u XB-C18 100A柱（100 mm×4.6 mm ，5μm），流动相：以乙腈-0.1%磷酸水洗脱，流速1.0ml/min，检测波长：210nm，柱温40℃。结果阴性对照无干扰，熊果酸在13.5～53.9ng范围内线性关系良好（r=0.9999），平均回收率为98.3%，RSD=0.9（n=9），该法操作简便，方法稳定，专属性强，可作为三箭草和堂山楂含片的质量控制方法。 标签：山楂含片；HPLC；熊果酸；含量测定 三箭草和堂山楂含片由山楂、白砂糖制成。山楂中富含熊果酸等成分，具有疏肝理气，活血化瘀，助消化等功效，主要用于治疗脂肪肝和肝纤维化等症状。本研究采用HPLC法对三箭草和堂山楂含片中指标成分熊果酸进行含量测定。经查阅文献，尚未有对其成分熊果酸做含量测定的报道。 1 仪器与试药 1.1 仪器Aglient 1260生物惰性四元高效液相色谱仪，德国梅特勒-托利多XA205DU电子分析天平。 1.2样品山楂含片：广西梧州三箭制药有限公司保健品厂出品（批号20120816，20121217，20120320）；阴性样品：按处方缺山楂按工艺制备。熊果酸对照品购于中国药品生物制品检定所（批号：110742-200517，供含量测定用）；其他化学试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱phenomenex Kinete x2.6u XB-C18 100A柱（100 mm×4.6 mm ，5μm）；乙腈-0.1%磷酸水溶液（68：32）为流动相；流速为 1.0ml.min-1；检测波长为210nm。 2.2 对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品1.078mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml含107.8μg的溶液。 2.3 供试品溶液的制备精密量取本品粉末3g，置于50ml锥形瓶中，精密加入20ml甲醇，称定重量，超声20min，放置室温后用甲醇补足重量，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。 2.4 测定法分别精密吸取对照品和供试品溶液各4μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积积分值。按外标法以峰面积计算，即得。 2.5 专属性考察取阴性样品，按2.3制备阴性供试品溶液，按2.1 色谱条
紫外分光光度法测定锁阳中熊果酸的含量
3 实验结果 蚕羌和鸡腿羌挥发油得率分别为1.4, 1.1ml/100g;相对密度分别为0.977,0.982; [α]20D分别为0.642 ,0.982 。 蚕羌挥发油共鉴定出57个化合物,含量为93.24%;鸡腿羌共鉴定出56个化合物,含量为87.34%(见附表)。 4 参考文献 1 中国药典.一部.1995:157 2 中国医学科学院药物研究所等.中药志.第一册.北京:人 民卫生出版社,1959:282 3 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴.第二册.北 京:科学出版社,1985:1099 4 中国药品生物制品鉴定所.中药材手册.北京:人民卫生出 版社,1992:117 5 Stenhageon E et al.Registry of Mass Spectral Data.Vol.1～ 2.New Y ork:John Wiley&Sons Inc,1974 6 Heller S R et al.EPA/NIH Mass Spectral Data Base.Vol.1 ～2. Washington:US G overnment Printing Office,1978致谢 本院中药研究所徐植灵研究员、吉力副研究员代做GC2MS。 1996210216收稿 紫外分光光度法测定锁阳中熊果酸的含量 丁红 王毅 王胜勇 (山西医科大学药学系 太原030001) 游万兴 (山西省药品检验所 太原030001) 摘要 通过薄层层析从锁阳中提取分离出熊果酸,并用紫外分光光度法测定其含量为0178%。实验平均回收率为9714%,RSD=0.45%(n=4)。 关键词 锁阳 熊果酸 紫外分光光度法 中药锁阳为锁阳的干燥肉质茎,性甘、温,具有补肾阳,益精血,润肠通便的功能,用于腰膝痿软,阳痿滑精及肠燥便秘[1],是中医临床上兴阳益精,抗衰老的重要药物。据文献报道,锁阳含有熊果酸、β2谷甾醇、胡萝卜甙[2],其中熊果酸具有安定,降温,抗菌,抗炎,降酶,抗癌等作用[3]。因此,测定锁阳中熊果酸的含量可为评价药材内在质量提供依据,也可对制定含有锁阳的中药制剂质量标准有一定意义。 1 仪器与药品 岛津UV2260紫外分光光度仪,UV2Ⅰ型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)。锁阳Herba Cynomorii购自太原市药材公司,内蒙产,山西省药品检验所顾腾喧教授鉴定。熊果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。硅胶G为青岛海洋化工厂生产,甲醇、丙酮等均为分析纯,北京化工厂生产。 2 实验方法和结果 211 薄层层析条件 硅胶G薄层板,展开剂石油醚2丙酮2甲醇(7∶3∶4),展距15.6cm。喷95%磷钼酸乙醇液, 110℃加热5min显色,254nm紫外灯下确定熊果酸荧光区。 212 标准曲线的测定 分别量取熊果酸对照液0.05,0.10,0.15, 0.20,0.25,0.30,0.40ml置5ml容量瓶中,甲醇定溶。甲醇为空白,204nm波长处分别测其吸收度。回归方程Y=101046X+010453,r= 019998。在010104mg/ml～010832mg/ml范围内呈良好线性关系。 213 样品测定 锁阳干燥粉末(40目)10g,80ml甲醇水浴
熊果酸的含量测定
野蔷薇根中熊果酸的提取工艺研究 努尔皮达·阿卜拉江，其买古丽·阿沙木，迪丽努尔·马里克* （新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐840054） 摘要：目的：优选野蔷薇根中熊果酸的超声提取工艺。方法：使用超声波提取法，采用L9(34)正交设计实验，用高效液相色谱法测定熊果酸的含量，确定最佳提取工艺条件。结果表明：野蔷薇根中熊果酸的提取最佳工艺是超声功率为600W，超声频率为工作5s间歇5s，料液比1：25，提取时间为30min，各因素的影响依次为超声波频率> 超声波功率>料液比和提取时间。结论：超声辅助提取野蔷薇根中熊果酸是一种简单、快捷、高效的提取方法。关键词：野蔷薇；熊果酸；超声提取；HPLC法 Study on extraction technology of Ursolic acid in Rosa multiflora Thunb NURPIDA·Ablajan，QIMANGUL·Hasan，DILNUR·Malik (School of chemistry and chemical engineering xin jiang normol university，Urumqi 830054）Abstract:objective: to optimize the ultrasonic extraction of Ursolic acid in Rosa multiflora Thumb . Method: by utilizing the ultrasonic extraction method and using the orthogonal test of L9(34), with high-performance liquid chromatography (HPLC) to determine ursolic acid content and the optimum extraction conditions. The results show that the order of each factor affecting the extraction was ultrasonic frequency>ultrasonic power>ratio of liquid to material>extracting time, and the optimum conditions of extracting ursolic acid from the root of wild roses were as follows: ultrasonic power 600W, ultrasonic frequency of resting for 5s in the working period of 5s,ratio of liquid to material 1:25, extracting time 30min, . Conclusion: the ultrasonic-assisted extracting of ursolic acid from the root of wild roses is a simple, quick way of extraction with high efficiency. Keywords: Rosa multiflora ; ursolic acid; Ultrasonic Extraction ; HPLC method 熊果酸(Ursolic acid)，又名乌苏酸、乌索酸、α-香树脂醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物[1]。熊果酸纯品为白色针状结晶(乙醇中结晶)，味苦，具有多种生物活性，有镇静、抗炎、抗菌，降低血糖，抗肝炎[2]等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能[3]，所以是一种很有开发价值的植物活性成分，被广泛地用作医药和化妆品原料，日本等国家已经将其作为天然抗氧化剂应用于食品中 *基金项目：国家自然科学基金（21165018）项目资助 作者简介：努尔皮达，女，（维吾尔族）硕士研究生，主要从事天然产物的研究。 联系作者：迪丽努尔.马里克（1964-），女，教授，主要从事天然产物研究。（pkudilnur@https://www.sodocs.net/doc/f93500621.html,）
山楂核中熊果酸含量的HPLC测定
山楂核中熊果酸含量的HPLC 测定 杨晓彤 程乐乐 糜 可 周韵丽 杨庆尧 上海师范大学微生物与免疫学研究所 (上海 200024) 摘要:采用C 18反相高效液相色谱RP -HPLC 法对山楂核中的熊果酸作含量测定。结果:测得山楂核中的熊果酸含量为01577mg/g,回收率为103113%,保留时间和峰面积的变异系数分别为0118%和1168%(n =8)。山楂核甲醇萃取液在作HPLC 分析前,先用硅胶柱吸附,再用洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,可去除大部分杂质,提高测定效果。 关键词:山楂核(Seed of Crataegus pinnati fida ),熊果酸,RP-HPLC 中图分类号:R 282.6 文献标识码:B 文章编号:1008-861X(2001)01-0055-03 基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(96011) 熊果酸(Ursolic acid,UA )属三萜类化合物,广泛存在于山楂、乌梅、夏枯草等植物[1]。近年发现熊果酸除有抗炎、抗突变活性外,对多种恶性肿瘤细胞亦有强烈的毒杀效应[2~4],并有诱导癌细胞分化的能力[5]。已知山楂中含熊果酸[6]。有人在山楂核中也检测到熊果酸[7],但迄今未见其含量报道。本文用HPLC 测定了山楂核中的熊果酸含量。1 仪器与材料 仪器:Beckman Gold System 高效液相色谱仪及软件,125型泵,168型紫外二极管阵列检测器;Beckman Ultrasphere C18反相柱(416@250mm,加416@50mm 保护柱);旋转蒸发器为B chi 公司产品;C Q250超声波发生器产自上海超声仪器厂。 材料:熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供。山楂购自天津市场,品种名:大红袍。测定用甲醇为色谱级。提取用试剂(甲醇、环己烷、乙酸乙酯、冰醋酸)均为化学纯。层析硅胶为上海五四化学试剂厂产品。2 方法与结果 2.1 山楂核样品制备、预处理及熊果酸检出 2.1.1 样品提取: 将鲜山楂沸水煮1min 后,分离山楂核,60~80e 烘干,打成200目的细粉,精密称取山楂核粉1g,加100ml 甲醇,90e 水浴回流提取6h 或置超声波发生器内超声提取1h,过滤,取滤液减压蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5ml,待作硅胶柱预处理。 2.1.2 硅胶柱预处理: 取100g 层析用硅胶,用二倍柱体积的洗脱液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1,V/V)洗脱,100e 烘至无酸味。取118g 装成id 8@85mm 的硅胶柱。精密吸取015ml 待处理样品于硅胶柱上,待甲醇挥干后用7ml 层析液(环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=12B 4B 1)洗脱,收集洗脱液,减压蒸干,用甲醇溶解并定容至1ml,0122mm 膜过滤后进行HPLC 分析。 2.1.3 样品测定结果 山楂核提取样品经硅胶柱预处理后上HPLC 仪测定,测定用流动相为甲醇/水(用甲酸调p H 至3)=95/5(V/V);流速:1ml/min;进样量:20L l;在215nm 波长下检测,用熊果酸标准品作对照。结果:样品在熊果酸标准品的出峰位置上出现相同的色谱峰(图1)。另在样品中加入熊果酸标准品后该峰的面积增加,但保留时间未改变,且没有出现新增的峰(图2) 。 a:山楂核甲醇提取物 b:熊果酸 Me than ol extract of the Ursolic acid(uA)S eeds of C.pinnati fida 图1 山楂核甲醇提取物与熊果酸标准品HP LC 色谱图 Fig.1 HPLC ch romatograms of m eth an ol extract of the seeds of C.pinnati fida 除上述色谱图外,另以每秒4次的频率记录190~320nm 范围内的光谱吸收,结果两者的光谱吸收图完全一致,其最大吸收在204nm(图3a)。将上述光谱进一步作二阶导数变换,其二阶导数光谱也完全一致(图3b)。由此可见两者为同一物质,山楂核提取物中的该色谱峰为熊果酸吸收峰。 第15卷第1期2001年3月 上海中医药大学学报 ACT A UNI VERSIT ATIS TRADI TIONIS MEDIC AL IS SINENSIS P HARMACOL OGIAEQUE S HANGHAI VOL.15NO.1 Ma r.,2001
熊果酸
枇杷叶提取物 药材来源及工艺： 熊果酸以游离形式或与糖结合成苷的形式分布于约7 个科46个属62种植 物 。主要为木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)叶，杜鹃药科植物熊果 Actostaphylos uva-ursi(L.)Spreng ，蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl. 的叶，玄参科植物毛泡桐（Paulownia tomentosa(Thunb.)Steud.）叶，唇形科植物夏枯草(Prunella vulgaris L.)的全 草，冬青科冬青属铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)的叶等。 性状： 本品为类白色粉末。 可供规格： 熊果酸：25%—95%（HPLC ） 功能： 熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。 1 保肝，抗肝炎作用 熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点。 印度学者Saraswat 等 发现熊果酸(5～20 mg?kg ) 对CC1 引起的大鼠肝毒性有保护作用。用熊果酸作预处理可明显提高大鼠肝细胞的成活率，并在实验中观察到熊果酸具有抗胆汁淤积的作用，胆汁流量及其内容物均有增加。由CC1 的作用机制推测熊果酸对损伤肝细胞的治疗作用机制可能与其同分异构体齐墩果酸相似，在于保护和稳定肝细胞膜及细胞器的生物膜系统，使其变动通透及主动运输功能恢复正常，细胞内外离子和水的移动及分布亦随之复原，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。 “抗肝炎中药一类新药乌索酸及其制剂的研究开发”课题取得重大进展，被列入2002年国家“863”计划，获国家科研资助经费100万元，成为国家级重大研究课题（2002AA2Z3217）。 2 抗肿瘤作用 熊果酸还对多种致癌、促癌物有抵抗作用，研究发现熊果酸能明显抑制HL －60细胞增殖，并诱导其凋亡；能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显着提高，能抑制人舌鳞癌细胞株TSCCa 细胞增殖，对TSCCa 细胞的半数生长的抑制剂量约为12.5 μmol?L －1，在24h 内表现为一定的量效关系；原位杂交显示熊果酸对TSCCa 细胞的抑制作用与抑制核转录因子的原位表达有关。。体内试验证明熊果酸可以明显增强机体免疫功能。说明熊果酸的抗肿瘤作用广泛，熊果酸极有可能成为低毒有效的新型抗癌药物。 熊果酸对肿瘤形成生长各阶段具有预防和抑制作用，抑制肿瘤形成生长以及诱导癌细胞分化作用。Li J 等通过实验及临床试验证明熊果酸能抗DNA 突变、抑制癌变的启动, 并且熊果酸能对抗致癌物如苯并芘，黄曲霉毒素Bl 诱发基因突变。王鹏试验对早期抗体(EBV-EA)活化试验型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂，发现熊果酸对TPA 诱导Raji 细胞EBV-EA 活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使Raji 细胞的存活率更高；利用同位素标记的佛酯化合物3H-PDB2证明熊果酸不影响TPA 与受体的结合，不是通过竞争TPA 位点，而是有效地阻断致癌物与受体结合后的环节发挥作用。Guevara 等研究显示熊果酸能使诱变剂所致的多染色质的微核红细胞数减少76％ 。 Ohigachi 等研究结果显示熊果酸对佛波酯(TPA)诱导 Raji 细胞EBA —EA 活化有抑制作用，其程度与维甲酸几乎相同，Raji 细胞存
熊果酸功能作用及其研究发展1
熊果酸功能作用及其研究发展 [摘要]：熊果酸属五环三萜类化合物，来源丰富，具有广泛的生物活性。概述了熊果酸的功能作用，几种提取纯化方法以及应用。着重论述了熊果酸在医药领域的研究发展，特别是熊果酸的抗肿瘤活性和抗心血管疾 病。 [关键词]：熊果酸；功能作用；提取；应用 熊果酸（Ursolic acid,UA）,又名乌索酸、乌苏酸、α-香树脂醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物，是多种天然产物的功能成分。熊果酸成品为白色针状结晶（乙醇中结晶），味苦，其基本骨架是多氧蒎的五环母核。化学式C30H48O3,相对分子质量456.68，熔点285~291℃，易溶于二氧六环﹑吡啶，可溶于甲醇﹑乙醇﹑丁醇﹑丁酮，略溶于丙酮，微溶于苯﹑氯仿﹑乙醚，不溶于水和石油醚[1]。 熊果酸为五环三萜类化合物，广泛分布于植物界，存在于杜鹃花科植物熊果酸的叶和果实﹑玄参科植物毛泡桐的叶﹑茜草科植物栀子的果实﹑龙胆科植物湿生蕾﹑木犀科植物女贞的叶﹑紫薇科植物毛子草的地上部分。熊果酸在药用植物中分布同样广泛，现已从30多种药用植物中提取到熊果酸，如女贞子﹑山楂﹑夏枯草﹑栀子﹑白花蛇舌草﹑山香圆叶﹑石楠叶﹑猫须草﹑锁阳﹑拘骨草等[16]。但因植物中所含成分的复杂性，含量低，致使提取分离难度大，不易形成批量生产。且熊果酸还具有毒性低﹑毒性周期短的特点，所以也是一种毒副作用较小的天然药物。 1熊果酸的功能作 熊果酸存在于天然植物中，且具有广泛的生物活性，尤其在抗肿瘤，抗心血管疾病以及保肝方面的作用显著。且具有镇静﹑抗炎﹑抗菌﹑抗糖尿病﹑抗溃疡﹑降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛用做医药和化妆品原料。 1.1抗肿瘤作用 抗肿瘤活性是熊果酸最主要的药理作用。研究表明，熊果酸对肿瘤具有明显抑制生长作用，能抑制白血病细胞HL-60﹑人红白血病细胞系细胞K562和人舌鳞肿瘤细胞TSCCa等细胞增殖，对T细胞淋巴瘤Jurkat具有明显的抗肿瘤活性。Lee等用熊果酸进行了6种肿瘤细胞系的细胞毒实验，结果表明熊果酸对白血病细胞P-388和L-1210，人肺腺肿瘤细胞A-549有显著的细胞毒作用，其ED50均小于4㎎?L-1。熊果酸对肿瘤细胞KB﹑人结肠肿瘤细胞HCT-8，乳腺肿瘤细胞MCF-7和CCRF-CEM 同样具有细胞毒作用。 熊果酸对人肿瘤细胞A431增值的抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性，这种抑制作用在停药以后能部分逆转。熊果酸长时间作用于细胞可表现出细胞毒和抑制细胞生长的双重作用。熊果酸对酪氨酸的抑制同样呈剂量依赖性。 Lee等认为，熊果酸能使肿瘤在生长﹑氧消耗及肿瘤间质液压方面发生改变。通过M T法促克隆和生长延迟实验发现，熊果酸抑制肿瘤作用明显。用Clark电极室测定发现，熊果酸能降低细胞耗氧量。FsaⅡ细胞在熊果酸100㎎?㎏-1的剂量下，其生长状态被显著抑制，熊果酸诱导的细胞凋亡也显著增加。 熊果酸能抑制人类克隆肿瘤细胞系HCT15。将HCT15细胞用熊果酸进行处理，光镜下发现许多细胞都开始退化，细胞的繁殖能力显著下降。在24~72h期间，死亡细胞的数量明显增加，大部分细
熊果酸的研究进展
作者：肖坤福郑云法刘成左张春牛 【关键词】熊果酸；,,,检测方法；,,,提取方法；,,,动物实验；,,,临床研究熊果酸是广泛存在于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等天然植物中的一种五环三萜类化合物，有研究表明熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖等多种生物学效应，早在1996年，日本学者神藏美枝子等人从杜鹃花科越桔属植物越桔叶中提取了具有较高熊果酸浓度的熊果酸产品，产品中除含有25%的熊果酸外，尚含有大量的熊果酸衍生物、熊果苷和其它三萜类化合物等，具有多种活性成分，用于增强机体免疫力、预防心血管系统疾病、稳定肝功能等。现在人们对其研究越来越多，并在很多方面取得了可喜的研究进展。 1 提取方法 对三萜类化合物的分离提纯是其研究起点，没有较好的提取工艺，就更谈不上对其进一步研究。近年来，许多科研工作者在这方面做出了突出的贡献。有些科研工作者［1～5］，通过正交实验确定85%～95%的乙醇提取熊果酸效果最佳。崔星明等［6］采用超临界流体萃取得到的芦笋提取物，用甲醇溶解，采用液相色谱-质谱联用仪检测，得到了56个组分。发现有保留时间和熊果酸基本一致的峰。其质谱分子离子峰和特征碎片峰都与熊果酸的一致，确定该化合物为熊果酸。 2 检测方法 在检测方法方面，有不少科研工作者对其进行了较深入的研究。熊慧敏［7］全面地论证了薄层层析-双波长扫描法测定大山楂咀嚼片中熊果酸含量的检测限的线性范围可行性，并考查了此方法的测定熊果酸的稳定性和重复性，从而证明薄层层析-双波长扫描法测定熊果酸精密度、稳定性、重现性、回收率均都达有关规定的要求，本方法操作简单方便，结果可靠，可作为检验产品质量的一个快速而实用的定量方法。朱玉琴等［8］在采用薄层扫描检测保驾胶囊中熊果酸的含量时首次对显色剂进行了改进，并验证了醋酸-浓硫酸 (9∶1)比10%硫酸乙醇显色要好，检测限低等优点。与此同时，杨云等［9］在采用薄层层析检测牙周康泰胶囊熊果酸的含量验证了10%磷钼酸乙醇液比10%硫酸乙醇显色要好。 罗启剑等［10］采用分光光度法测定连钱草中熊果酸含量。郭艳玲等［11］和陈志强［12］采用薄层扫描法分别测定了补肾颗粒和消食贴中熊果酸含量，方法简便、快速、准确，可作为该产品的质量控制方法。 周静等［13］探求用毛细管气相色谱法测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸含量。取女贞子氯仿提取液自然挥发干，甲醇溶解经甲酯化后，进样分析。色谱条件：hp－1毛细管柱（25 cm×0.32 mm，0.52 μm），柱温280℃，氮气为载气，氢火焰检测器。分析结果表明熊果酸的线性良好，回收率为99.8%±2.1%。所建立的气相色谱法可以作为女贞子药材的质量检测方法。 施慧君等［14］采用hplc法测定知柏地黄冲剂中熊果酸的含量。选用ods-c：色谱柱，流动相：甲醇-水(99∶1)，磷酸调ph 2.5，检测波长：206 nm，流速：1.2 ml/min，柱温25℃的条件下，熊果酸线性关系良好(r=0.999 8) 平均回收率达98.7%(rsd=0.66%)。罗晓清等［15］采用rp-hplc法测定石精叶中熊果酸含量，色谱柱为zorbax ods柱，用甲醇（1%），醋酸水溶液(88∶12)为流动相。检测波长为215nm。结果熊果酸和齐墩果酸的平均收率分别为98.5%、97.6%(n=3)。rsd分别为1.62%，1.89%(n=3)。方法准确、灵教、快速，可作为石抽叶药材的质量检测方法之一。 杨书良等［16］采用高效液相色谱法从影响熊果酸测定的各个方面(例如：粒度、煎煮次数、溶媒量、提取时间等)进行测定和和正交分析，从而论证了它比薄层层析法更精确、更可靠、灵敏度更高，重现性更好。鞠建华等［17］，也采用高效液相色谱测定熊果酸含量，但他在前人的基础上调节流动相的比例和加入改性剂乙酸胺，验证了此改进方法可以使熊果酸和它的同分异构体齐墩果酸达到基线分离，并使基线平稳、峰型和分离效果较佳。鄢立新等