冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)

（1）冰冻切片室温晾干15分钟；

（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；

（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；

（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；

（7）PBS洗3次，每次15分钟；

（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；

（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

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注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：

（1）pH7.4 0.01MPBS：

配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g

0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O

5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4

（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存

（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存

（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装

1ml/支－20℃保存

一、操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用(??不用固定吗？--weibin )。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。三、冰冻切片的快速染色方法：

①切片固定30秒－1分钟。

②水洗。

③染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤于碱水中返蓝20秒。

⑥伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用.

常规方法：

（1）冰冻切片固定10～30 s

（2）稍水洗1～2 s

（3）苏木精液染色（60℃）30～60 s （4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s

（6）稍水洗1～2 s

（7）促蓝液返蓝5～10 s

（8）流水冲洗15～30 s

（9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水稍洗1～2 s

（11）80%乙醇1～2 s

（12）95%乙醇1～2 s

（13）无水乙醇1～2 s

（14）石炭酸二甲苯2～3 s

（15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s

（16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s

（17）中性树胶封固。

冰冻切片实验方案和HE染色

2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤） 冰冻切片操作方法及步骤： 1取材：(昆明小鼠各个组织或器官) 取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 2包埋： 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。 3修平： 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。 4切片： 调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 5调防卷板： 制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。 冰冻切片时的注意事项： 1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 6 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

HE染色、免疫组化

HE染色步骤： 1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、 二甲苯3各15分钟；100%酒精1、 100%酒精2、95%酒精1、95%酒 精2各5分钟；90%酒精3分钟； 80%酒精2~3分钟），自来水冲洗 （洗酒精的） 2.苏木素染色5分钟，自来水冲洗， 1%的盐酸乙醇分化（处理结合过 多的苏木素），自来水冲洗，返蓝 液返蓝（使胞核更加蓝化），自来 水冲洗，伊红染色1.5~2分钟，自 来水快速冲洗 3.脱水（80%、90%、两个95%涮洗 即过，两个100%各3~5分钟）

4.二甲苯透明：二甲苯1、二甲苯2、 二甲苯3各2分钟 5.封片：盖玻片 免疫组化染色： 1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、 二甲苯3各15分钟；100%酒精1、 100%酒精2、95%酒精1、95%酒 精2各5分钟；90%酒精3分钟； 80%酒精2~3分钟），自来水冲洗 （洗酒精的） 2.抗原修复：根据抗体说明书，选择 抗原修复液（分两种：一、柠檬酸 修复液配方——A柠檬酸钠29.41g 溶入1000ml蒸馏水、B柠檬酸21g

溶入1000ml蒸馏水，取A液 41ml+B液9ml+450ml蒸馏水，测 PH6.0，把配好的修复液放入高压 锅里，开始加热待修复液沸腾后， 将脱蜡好的片子放入耐高温的修 复夹中，一起放入高压锅里，盖好 锅盖等待锅嗤嗤响时，开始计时1 分40秒），时间到后关火，把锅放 入水池中降温，开小水冲洗缓慢降 温，等锅凉后把锅打开，取出修复 夹，自来水冲洗。画圈（画圈笔或 石蜡，目的节省抗体） 3.3%过氧化氢封闭（针对石蜡切片 中的红细胞），0.3%过氧化氢封闭 （针对冰冻切片和爬片的红细胞），

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT； （3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜； （5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项： （1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）： （1）pH 7.4

0.01MPBS： 配方为： 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为： Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2- 7.4 （2）洗涤液： 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4

病理片HE染色步骤

病理片 HE染色步骤： 烤片80度半小时 (1)二甲苯（Ⅰ）5min (2)二甲苯（Ⅱ）5 min (3)二甲苯（III）5min (4)100%乙醇（Ⅰ）2min (5)90%乙醇（Ⅱ） 2 min (6)80%乙醇（III）2min (7)70%乙醇（IV）2 min (8) 流水冲洗5min (9) 苏木精液染色5 min (10) 流水稍洗去苏木精液1-3 s (11) 1%盐酸乙醇1-3 s (12)流水过洗至返蓝 (13) 0.5%伊红液染色1-3 min (14) 蒸馏水稍洗1-2 s (15) 80%乙醇稍洗1-2 s (16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (17) 100%乙醇（Ⅱ）3-5 s (18) 二甲苯（Ⅰ）2 min (19) 二甲苯（Ⅱ）2 min (20) 二甲苯（Ⅲ）2 min (21) 中性树胶封固

* 冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30 s （2）水洗1～2 s （3）苏木精液染色（60℃）30～60 s （4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s （6）稍水洗1～2 s （7）促蓝液返蓝 （8）流水冲洗15～30 s （9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水洗1～2 s （11）80%乙醇1～2 s （12）95%乙醇1～2 s （13）无水乙醇1～2 s （14）石炭酸二甲苯2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s （17）中性树胶封固。 H-E染色评定标准： （1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 ` 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4

（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装 1ml/支－20℃保存 一、操作方法及步骤： ①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 二、冰冻切片时的注意事项： ①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 ②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 ③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

冰冻切片HE染色步骤

冰冻切片HE染色步骤 1.组织包埋，使用OCT 首先，需要用铝箔纸制作一个模子。在模子里放入一些OCT，然后将96孔板放在液氮上。接着，将放有OCT的模子放在96孔板上，以防止铝箔纸模接触到液氮。等待OCT凝固后，取出模子，将修剪好的组织放在凝固的OCT上，再用OCT将组织包埋起来。不要包埋太多，然后将其放回液氮中，等待OCT全部凝固后，放入-80°冰箱保存。 2.冰冻切片机上切片 当需要切片时，取出切片，放入冰冻切片机中，使其恢复一段时间，大约30分钟到60分钟。 3.固定 将切好的片子自然晾干，然后使用固定液A固定30秒至60秒。接着，水冲洗30秒，再使用固定液B固定60秒。固

定液A的配制方法为：80%中性福尔马林+19%至95%乙醇+1%冰醋酸。固定液B的配制方法为：75%无水乙醇+25%冰醋酸。中性福尔马林的配制方法为：90%PBS+10%至40%甲醛。 4.取出已经切好及固定好的冰冻切片 取出已经切好及固定好的冰冻切片，短期放入泡沫盒中，放少许水，制作成湿盒保存切片；长期放入-20度冰箱保存， 以防止组织变形。 5.苏木素染色 将切片放入苏木素中染色10分钟。成熟苏木素的制作方 法是，加入碘酸钠，即0.2克碘酸钠/L苏木素。 6.水冲洗 用水冲洗切片。 7.1%盐酸乙醇5秒

将切片放入1%盐酸乙醇中，重复5次，使得细胞核与细 胞质分化。1%盐酸乙醇的制作方法是，将1%的HCl加入99%无水乙醇中。 8.放入水中10分钟 将切片放入水中10分钟。 9.放入XXX5分钟 将切片放入XXX中染色5分钟。 10.使用乙醇洗涤 最后，使用80%、95%、100%乙醇依次洗涤，每个2秒，将XXX洗掉。

冰冻切片的免疫荧光

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min