冰冻切片免疫荧光
冰冻切片免疫荧光
1.处死实验动物，打开脑壳，避免损伤脑组织，
2.把把脑组织小心取出，放置于平皿中，取出目标部位；
3.用室温下的PBS或生理盐水漂洗目标部位1-3遍，把血液漂洗干净（血液导
致背景较高）；
4.小心把目标部位转移至滤纸上，小心把组织表面的溶液用滤纸吸干；
5.再把目标部位转移干燥平皿中，在-20℃或-80℃冻结（绝对避免用液氮冻结）
后，再把目标部位转移至管子中（绝对避免挤压组织，应使用硬性管子），做好相应标记，存储于-20℃或-80℃（绝对避免复融，如需进行其他实验，组织应在冻结前分切好）；
6.利用Leica CM 1850 UV切片机进行冰冻切片；
7.冰冻切片丙酮固定10分钟。
8.PBS洗2次，每次5分钟。
9.10%正常山羊血清封闭30分钟。
10.一抗（通过预实验筛选抗体的最优浓度，利用免疫一抗稀释液稀释抗体）4℃
孵育过夜。
11.PBS洗3次，每次5分钟。
12.荧光标记二抗（通过预实验筛选的抗体最优浓度，利用免疫二抗稀释液稀释
抗体）室温湿盒避光孵育1小时。
13.PBS洗3次，每次5分钟，避光操作。
14.DAPI室温湿盒避光孵育5分钟。
15.PBS洗一次，5分钟，避光操作。
16.抗荧光淬灭剂封片。
17.镜检，拍照。
18．备注：如果进行双标，相应一抗应来源于不同的种属（例如一个是属抗，另一个是兔抗）；如果背景较高，应使用背景荧光淬灭剂处理；通过预实验确定一抗、二抗的最优浓度，以及是否需要使用背景荧光淬灭剂处理；
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告
3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。 4.注意： 1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。 2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）
分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。 3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。 4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。 5）切片甩干，擦去多余PBS。滴加适量的二抗，盖好湿盒。于37℃恒温培养箱孵育2小时。注意加二抗过程及孵育过程中避光。 6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。 7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。于37℃继续孵育8分钟。注意实验过程中避光。 8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。 9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。 4.封片 1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。 2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边 5.镜下观察 立即用荧光显微镜观察。 注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光染色SOP
免疫荧光染色SOP 肾活检冰冻切片免疫荧光染 色（直接法） 一．试剂 1.冷冻包埋剂OCT 2.荧光抗体：IgG-FITC （1：100），IgA-FITC（1：200），IgM-FITC（1：300）， C3-FITC（1：100）， C1q-FITC（1：150） 3.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 4.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ）二．取材 1.准备液氮罐、冷冻架、塑料小凹、OCT 2.活检标本取出后，立即浸入塑料小凹OCT中，置液氮罐 内冷冻架上速冻约10秒 3.置恒冷切片机内立即行冰冻切片（切片厚度为3um） 三、固定 1.待冰冻切片充分干燥后，立即放入纯丙酮固定7min，吹干，收至低温冰箱保存。 2.固定后的冰冻切片已干燥，可直接染色，如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干，方可染色。 四、抗原抗体反应过程 1. IgG , C3加一抗前用TBS孵育15min， IgA，IgM ，C1q 加一抗前用10%小牛血清封闭15min。（10%小牛血清为PBS稀释） 2. 去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵 育40min
3. 流水冲洗，置95%酒精2min，吹干 4. 甘油封片，荧光显微镜观察结果 五、注意事项 1.冷冻标本时间要掌握好，防止过软或碎裂 2.切片温度需适宜，不宜过高或过低 3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光 4.多聚赖氨酸、丙酮、酒精、缓冲液必须及时定期更换 肾活检石蜡切片免疫荧光染 色（间接法） 一、试剂 一抗：IgG（1：50）IgA（1：50）IgM（1：50）C3（1：50）C1q（1：50）以上均为 DAKO公司产品 1.二抗猪抗兔-FITC （ 1：50，DAKO公司） 2.EDTA(PH=8.0) 3.胃蛋白酶（Invitrogen） 4.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 5.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ） 二、方法 1.光镜石蜡切片脱蜡、入水 2.用高温高压修复15min(EDTA, PH=8.0)，冷却后水洗 3.胃蛋白酶室温消化5 min，水洗 4.10%小牛血清封闭（10%小牛血清为PBS稀释） 5.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温或4度过 夜 6.PBS冲洗2min。
免疫荧光双染
精心整理免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫 荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2 (1) (2) (3)
免疫荧光双染
免疫荧光双染 免疫荧光双染 Document number【AA80KGB-AA98YT-AAT8CB-2A6UT-A18GG】 免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、?冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮 固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流 走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵 育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、?加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂 1?(TdT)?和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭
30min。 6、?加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一 抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、?加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、?DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除 PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯 Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流 走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）
免疫荧光双染
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。 服务说明 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴 加蛋 白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释)覆盖组织，37度温箱孵育 30min。将玻片置于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗 涤 3 次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel 试剂盒内适量试剂
1（TdT和试剂2（dUTP按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆 盖组织，切片平放于湿盒内，37C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿 度。 5、B SA封闭： 将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次， 每次5min,在圈内滴加用3%BSA匀匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4 ° C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、x x： 玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温 孵育50min。 & DAPI复染细胞核： 切片用PBS（PH 7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片： 玻片置于PBS（PH
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT； （3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜； （5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项： （1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）： （1）pH 7.4
0.01MPBS： 配方为： 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为： Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2- 7.4 （2）洗涤液： 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4
免疫荧光双染
免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定 10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在 圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。