冰冻切片 免疫荧光组化

冰冻切片免疫荧光组化都是生物医学研究中常用的技术。

冰冻切片是将组织样本冻结后，使用切片机将其切成薄片，用于病理学研究、免疫组化等方面。冰冻切片是一种快速、简便的技术，适用于病理诊断，可以用于分析组织、细胞和细胞器的结构和功能。

免疫荧光组化是一种检测特定抗原或抗体在组织中分布情况的技术。它利用荧光染料与抗原或抗体的结合来检测它们在组织中的位置。这种技术可以用于研究细胞的分子结构和功能，诊断疾病，以及监测治疗的效果等。

在实际应用中，冰冻切片和免疫荧光组化常常结合使用。首先，使用冰冻切片制备细胞或组织切片，然后通过免疫荧光染色技术检测特定抗原或抗体在切片中的分布情况，从而获得更详细的细胞或组织结构信息。

免疫组化和荧光步骤修改版

免疫荧光染色（全程避光） （1）切片晾干后用0.01mol/L PBS（PH值7.2－7.4）漂洗10min×3次；（2）0. 3％Trion-100溶液37℃25min；0.01mol/LPBS漂洗10min×3次； （3）滴加5％BSA37℃封闭抗原25min，甩去多余液体，不洗；（4）滴加用1％封闭血清稀释的一抗50ul/张，置4℃冰箱40－48hr。 PBS洗10min×3次； （5）滴加1％封闭血清稀释的荧光二抗羊抗兔，室温下2h；PBS洗5min×2次；晾干，60％甘油封片。 荧光双标步骤同上，仅在滴加一抗和二抗时分别将两种一抗和二抗一起加入。但两种一抗需种属来源不同。 1.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min 2. 3 mL/L Triton X-100漂洗10 min。 3.正常羊血清封闭30 min。 4.一标一抗兔抗GFAP (北京中杉)孵育液,稀释度为1∶50，37℃孵育1 h,室温过夜（室温24~48 h）。 5.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min， 6.加入FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉)荧光二抗,稀释度为1： 50,37℃孵育1 h，0.01 mol/LPBS洗10×3 min。 7.捞片,阴干,甘油封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例) 1.冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟， PBS洗，5分钟×3。 2.用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3.PBS洗，5分钟×2。 4.5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5.PBS冲洗，5分钟×3次。 6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃ 孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 7.PBS冲洗，5分钟×3次。 8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵 育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 9.PBS冲洗，5分钟×3次。 10.显色剂显色（DAB或AEC）。 11.自来水充分冲洗，复染，封片。 另外是否做冰冻或者石蜡是有你所要检测的蛋白来决定的，买一抗的时候有要求。如果能做石蜡的话，虽然复杂点，但做出来的组织结构比冰冻的清晰，更好看。

冰冻切片免疫组化步骤

冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS 冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。

孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT； （3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜； （5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项： （1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）： （1）pH 7.4

0.01MPBS： 配方为： 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为： Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2- 7.4 （2）洗涤液： 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4

冰冻切片漂片

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片） 免疫组化步骤： 1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒； 2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片； 3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃； 5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。 6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。 7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。 8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。 9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。 免疫荧光步骤及注意事项： 1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍） 2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片； 3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时； 5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。注意避光操作。 6，0.01MPBS洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干； 7，滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。 常见问题： 1，荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。 2，背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。 另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。 免疫组织化学 1.边缘效应? 原因:1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致.解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。 2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。 2.产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？ 1.抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决办法:这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。 2.一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。 3.内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色； 4.非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果； 5.DAB孵育时间过长或浓度过高； 6.PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要； 7.标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。 3.免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

冰冻切片免疫组化步骤

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，

室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。 创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王*

冰冻切片免疫组化步骤

冰冻切片免疫组化步调之阳早格格创做 1.需要准备的资料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多散甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L苦氨酸） 2.冰冻切片 与出构造块搁于硬塑料盖或者特造的小盒内，之后将其缓缓仄搁于衰有液氮的小杯内，让盒底部交触液氮（小盒及构造块切勿浸进液氮内），约莫10-20秒构造即赶快冰冻成块.与出构造冰块坐时置于-80℃冰箱储藏备用，或者置于恒温切片机冰冻切片. 切片薄度4-8 um (5 um)，对付于免疫组化的需要用APES 包被的载玻片，以减少构造片的粘附性. 切片后如没有坐时染色，必须吹搞，储藏于矮温冰箱内保存. 3.免疫组化染色步调 牢固：与出切片，室温搁置5mins.用4%的多散甲醛PBS 溶液室温牢固15mins，PBS清洗三次（清洗不妨采与侧斜淋洗，也可至于仄皿中摇摆）. 挨孔：如果是需要染细胞内的蛋黑，用直推通（TritonX-100）挨孔：构造样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，屡屡5mins.如果是染膜蛋黑的，没有需要直推通挨孔. 启关：将构造置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，启关非特同性粘合的抗体.对付于多散甲醛牢固并举止免疫荧光的样原，正在启关缓冲液中加进0.3mol/L的苦氨酸. 孵化：构造样原浸于一抗（用含1%BSA的PBST密释），搁于干盒中，室温1h或者4℃过夜.用PBS洗3次，屡屡5mins. 浸进两抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h.PBS洗3次，屡屡5mins. 染色：浸进0.1-1ug/mL的DAPI或者Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次. 启片：用盖玻片启片，指甲油牢固，保存与4或者-20℃.

冰冻切片的免疫荧光

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min

冰冻切片免疫组化步骤

冰冻切片免疫组化步调 1.需要准备的资料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保管。 3.免疫组化染色步调 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS 冲洗三次（冲洗可以采取侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保管与4或-20℃。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤 冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。 11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。 二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。 4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。 7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。 8. PBS冲洗，2分钟×3次。 9. 显色剂显色（DAB或AEC）。 10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

冰冻切片免疫组化步骤

冰冻切片免疫组化步骤Prepared on 21 November 2021

冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8um(5um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含 0.25%TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。

冰冻切片免疫组化步骤

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冰冻切片免疫组化步骤 1.需要准备的材料 APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛 PBST（含Tween-20） PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸） 2.冰冻切片 取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。 切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。 切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。 3.免疫组化染色步骤 固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定 15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。 打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次 5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。 封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入 0.3mol/L的甘氨酸。 孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。 3