酿酒酵母载体质粒

酿酒酵母载体质粒

酿酒酵母载体质粒是指用于将目的基因引入酿酒酵母细胞中的质粒。质粒是一种环状的双链DNA分子，可独立于染色体存

在并繁殖。酿酒酵母载体质粒通常包含以下元素：

1. 原核起始子（promoter）：用于启动目的基因的转录，使其

产生蛋白质。

2. 选择性标记基因（selectable marker gene）：常用的选择性

标记基因包括对抗生素的抗性基因（如抗生素抗性基因）或与缺失酵母株的互补基因（如RNA聚合酶II基因）。选择性标

记基因能够在酵母细胞中提供抗性，使得只有表达该基因的转化细胞能够生长。

3. 多克隆位点（multiple cloning site，MCS）：用于将目的基

因插入质粒中，一般由多个限制性内切酶切割位点组成，方便将外源基因插入质粒。

4. 酿酒酵母起始子（promoter）：用于应用在酿酒酵母细胞中

工作的目的基因。

5. 终止子（terminator）：用于终止目的基因的转录。

通过插入目的基因到酿酒酵母载体质粒中，并经由转化等方法将质粒引入酿酒酵母细胞中，可以使得酵母细胞表达目的基因，从而进行相应的功能研究和应用实验。这种酿酒酵母载体质粒在酿酒酵母遗传工程中起到了重要作用。

pPICZαA质粒图谱

pPICZaa载体基本信息 出品公司: Invitrogen pPICZalpha A, pPICZαA, pPICZalphaA, pPICZαA, pPICZaA, 载体名称: pPICZa-A 质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: AOX1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 3593 bp 5' 测序引物及序列: 5′AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ 3' 测序引物及序列: 3′AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ 载体标签: C-Myc, C-His 载体抗性: Zeocin 博来霉素 筛选标记: HIS4 备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。 产品目录号: V195-20 稳定性: 稳定Stable 组成型: 组成型Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pPICZaa载体质粒图谱和多克隆位点信息

pPICZaa载体简介

pPICZαA，B和C是3.6 kb的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个N-端多肽，编码酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α-因子分泌信号。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。 pPICZαA，B和C系列载体包含以下元素： ?5'端含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz 等人，1989;tschopp等人，1987A）。 ?α-因子分泌信号能够分泌性表达目的蛋白。 ?Zeocin抗性基因在大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; Drocourt等人，1990）。 ?C-端含Myc和His标签，可以用于检测和纯化重组蛋白。 ?pPICZ A, B, C三种读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。pPICZaa载体序列

毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％

酿酒酵母

酿酒酵母 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）又称麫包酵母或者出芽酵母。 形态及大小：是一种直径为5微米 所属分类 域：真核域(Eukarya) 界：真菌界(Fungi) 门：子囊菌门(Ascomycota) 纲：半子囊菌纲(Hemiascomycetes) 目：酵母目(Saccharomycetales) 科：酵母科(Saccharomycetaceae) 属：酵母属(Saccharomyces) 种：酿酒酵母(S. cerevisiae) 酿酒酵母介绍 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。 酵母生活史 酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和α，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。 酿酒酵母基因组 酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释(annotation)，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库[1]由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。 在科学中的作用 因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细

酵母表达体系构建

酵母表达体系构建 酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。 一、选择酵母菌种和载体 1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。 2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。 二、目的基因的克隆和鉴定 1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。 2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。 3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。 4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。 三、构建酵母表达体系

1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。 2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。 3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。 4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。 5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。 6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。 四、注意事项 1．在构建酵母表达体系时，应注意选择无毒、无害的载体和宿主细胞，以确保生产出的生物制品安全可靠。 2．在转化和筛选过程中，应严格遵守操作规程，避免交叉污染和误操作导致实验失败。 3．在优化表达条件时，应综合考虑各种因素对目的基因表达的影响，以获得最佳的表达效果。 4．在生产与纯化过程中，应注意保持生产环境的清洁和卫生，以确保产品质量和安全。 5．在整个过程中，应注意记录实验数据和结果，并进行总结和分析，以便不断提高和完善酵母表达体系的构建和应用水平。 总之，构建酵母表达体系需要多方面的知识和技能，包括基因克

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定 摘要：采用PCR扩增酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ号染色体ARS304序列（S1）及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列（S2），并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中，获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1，说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。 关键词：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；自主复制序列（ARS）；重组质粒；复制起始活性 Construction and Identification of Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisiae ARS304 and Its Flank Sequence Abstract：ARS304 gene（S1）and its flank sequence（S2）of Saccharomyces cerevisiae were cloned by PCR，and then connected into the shuttle vector pRS405. Recombinant plasmids pRS1 and pRS2 were successfully constructed and used for electroporation of S. cerevisiae. Results showed that the electricity transformation rate of pRS2 was higher than that of pRS1，indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304 in S. cerevisiae. Key words：Saccharomyces cerevisiae；autonomously replicating sequence （ARS）；recombinant plasmids；replication origins activity 复制起始的调控涉及细胞周期的调控、基因扩增、肿瘤发生等重大生物学问题，是真核生物基因表达调控的重要内容。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中复制起始依赖的顺式作用元件被称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），典型的ARS有一段11 bp富含A/T的保守序列[5’-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3’]，称为ACS（ARS consensus sequence），这些位点发生突变时会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能。在酿酒酵母Ⅲ号染色体上已发现有19个ARS元件，但却存在超过3 800个与ACS 相似的序列，并且其中60%的序列能与ACS的8～10个位点匹配[1]，说明自主复制并不单纯受ACS元件数目、方向以及解旋基序数目所控制，其活性可能还与其他因素有关，诸如ARS侧翼序列特征、核小体定位、染色质修饰等[2]。对酵母的ARS进行研究，了解酵母染色体复制起始机制，有利于进一步在表观遗传学水平上探究真核生物复制机理。本实验构建并鉴定酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒，以期为以酵母为模式生物研究真核基因复制机制提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料

酵母基因工程

酵母基因工程 一酵母基因工程的发展现状 1.酿酒酵母自身的改造 （1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 （2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 （3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母 （4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达 （5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母 2酵母表达异源蛋白 （1）表达水平 （2）表达质量 2酵母基因工程的发展趋势 （1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷 （2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向 （3）利用酵母基因工程筛选更多新药 （4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 （5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注 3发展历程 1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补 了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母 全基因组的测序。 二．酵母基因工程的优点 1.安全无毒，不致病； 2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3.容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率； 4.培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能 三．酵母表达系统 （1）酵母表达载体 ①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。 原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。 酵母部分： 1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)； 整合型载体的整合介导区。 2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列 3基因启动子和终止子序列 4信号肽序列

酿酒酵母质粒的提取

酿酒酵母质粒的提取 酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。 一、酵母细胞质粒提取步骤： 1、接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。 2、第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下。 3、取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml 的1倍TE悬浮。 4、将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体。 5、取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体。 6、然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min。 7、将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min。

8、将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中。 9、1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min。 10、弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可。 11、跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了。

酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书

酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型） 目录号：PL19 目录编号包装单位 PL1901 10次 适用范围： 适用于大规模高纯度酵母质粒制备 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存10次（PL1901）RNaseA（10mg/ml）－20℃750μl 破壁酶4℃1g（常温运输） 溶液YP1 4℃75 ml 溶液YP2 室温75 ml 溶液YP3 室温110 ml 去蛋白液PD 室温100 ml 漂洗液WB 室温25 ml x 2 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温20 ml 吸附柱DC 室温10个 收集管（50ml）室温10个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100μg/ml） 置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几 分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少6,000xg， 带50ml转头的台式离心机。

所有质粒载体汇总

酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1， 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZα A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115， 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列， pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒： pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103

质粒的酿酒酵母转化实验报告

酿酒酵母转化实验报告 摘要 本文介绍了酿酒酵母转化实验的实验步骤和实验结果。首先，介绍了实验所使用的材料和 器材，以及实验的准备步骤，包括菌株的提取、培养基的种植和抗生素的添加等。其次， 介绍了质粒转化的步骤，包括提取质粒、构建质粒等。最后，介绍了实验结果，包括质粒 转化后酵母菌株的抗性检测和质粒转化效率的估算等。 关键词：酿酒酵母，质粒转化，抗性检测，质粒转化效率 1. 实验简介 酿酒酵母转化实验是一种常用的基因工程实验，它是将外源基因转入酿酒酵母中，以改变 酵母的生理特性和功能的一种方法。通过质粒转化，可以将外源基因转入酿酒酵母，从而 改变酵母的生理特性和功能，为酿酒酵母的改良和研究提供了便利。 2. 实验材料和器材 （1）材料：酿酒酵母菌株，质粒，抗生素，营养培养基，细胞溶解剂； （2）器材：离心机，离心管，烧杯，热水浴，烧杯架，离心瓶，烧杯支架，温度控制器，离心管支架，摇床，培养箱等。 3. 实验步骤 （1）菌株提取：将酿酒酵母菌株放入营养培养基中，摇床培养24小时，然后用离心机离 心提取菌液； （2）培养基种植：将菌液滴入营养培养基中，放入培养箱培养24小时； （3）抗生素添加：将抗生素添加到营养培养基中，放入培养箱培养24小时； （4）质粒提取：将质粒放入烧杯中，加入细胞溶解剂，热水浴溶解，然后用离心机离心；（5）构建质粒：将质粒和菌液混合，放入烧杯中，加入CaCl2，放入热水浴37℃反应 30min，然后用离心机离心； （6）质粒转化：将离心后的质粒液滴入培养基中，放入培养箱培养24小时； （7）抗性检测：将质粒转化后的酵母菌株放入营养培养基中，添加抗生素，放入培养箱 培养24小时，观察菌株是否有抗性。 4. 实验结果 （1）质粒转化后酵母菌株具有抗性：质粒转化后的酵母菌株在抗生素的作用下仍能够正 常生长，表明质粒转化后的酵母菌株具有抗性。 （2）质粒转化效率估算：通过对质粒转化后的酵母菌株的抗性检测，估算出质粒转化的 效率为85%。

2μm质粒

1.2μm质粒：一个闭合环状超螺旋DNA分子，长约2um。在酿酒酵母中发现的一种模 拟微生物。可用于研究基因调控、染色体复制的理想系统，也可作为酵母菌转化的有效载体，并组建基因工程菌。 2.菌落（p28、33、52）：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程 度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 3.效价（p71）：表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数又称噬菌斑形成单 4.培养基（pfu）或感染中心。测定的方法——双层平板法 培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水。 5.水活度(p93)：用aw表示，在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水含量。 在同温同压，某溶液的饱和蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比。aw =P/Po（P: 溶液的蒸汽压，Po:纯水的蒸汽压）在常温常压下，纯水的aw为1.00 6.抗生素（p182）：是一类由微生物或其它生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其 人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物（包括病原菌、病毒、癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。 7、克隆：名词指带有相同DNA序列的一个群体，可以是质粒也可以是基因组相同的细菌细胞群体。动词利用DNA体外的重组技术将一个特定的基因组DNA序列插在一个一个载体DNA分子上进行不变扩增。 糖被：包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的透明胶状物质。糖被的有无、厚薄除与菌种的遗传性相关外，还与环境尤其是营养条件密切相关。 荚膜：是原核生物生命过程中在它表面分泌层松散粘液物质的糖类位置在细胞壁最外层具有一定形态。 孢囊：一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下，由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。 芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造。 气生菌丝：当其孢子落在固体基质表面并发芽后，就不断伸长，分枝并不断向空间方向分化出颜色较深、直径较粗的分枝菌丝。 生活史：又称生命周期，指上一代生物个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程。 霉菌（mold）是丝状真菌的一个俗称，通常指那些菌丝体较为发达又不产生大型肉质子实体结构的真菌。 气生菌丝体：当霉菌孢子落在适宜的基质上后，就发芽生长并产生菌丝。由许多菌丝相互交织而成的一个菌丝集团称菌丝体。而伸展到空间的菌丝体则称为 假根：是Rhizopus(根霉属)等低等真菌匍匐菌丝与固体基质接触处分化出来的根状结构，具有固着和吸取养料等功能。 匍匐菌丝：毛霉目真菌在固体基质上常形成与表面平行、具有延伸功能的菌丝，又称匍匐枝。锁状联合：双核细胞构成的二级菌丝通过形成突起而连合两个细胞不断使双核细胞分裂，从而使菌丝尖端不断向前延伸 病毒是形体微小，结构简单，仅含有1种核酸DNA或RNA，具有超级寄生性，且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形态的微生物。分为真病毒和亚病毒。 温和噬菌体某些噬菌体侵染细菌后，将自身基因组整合到细菌细胞染色体上，随寄主细胞分裂而同步复制，并不引起细菌裂解释放噬菌体，因而被称作温和噬菌体。