酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权

【摘要】在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点.因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键.研究中,从酿酒酵母基因组中扩增

得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体pNTS2K中,得到4种复制整合型载体(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS735、pNTS2 K-ARS1512).经电转化后,4种转化子(36a(pNTS2 K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生长.然而,只有转化子

36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液体培养基里较快生长.经过G418耐受性检测后,36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418

的YPD培养基中很好地生长.此外,通过质粒pNTS2 K-A RS315表达荧光蛋白,其

表达效果高于普通商业质粒.实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主

复制,其中ARS315复制能力最强.因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础.%In the case of yeast expression,low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expression

vectors.Therefore,finding a high effective Saccharomyces cerevisiae autonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/integrated plasmid is significantly important.In this study,four different ARSs (ARS304,ARS315,ARS735,and ARS1512) were amplified from Saccharomyces cerevisiae and inserted into integrated

yeast vector pNTS2K and four plasmids pNTS2K-ARS304,pNTS2K-

ARS315,pNTS2K-ARS735,pNTS2K-ARS1512 were obtained.All the four plasmids were successfully transformed into S.cerevisiae and all transformants were able to grow on YPD plate containing 300 μg/mL of

G418.However,only transformant containing plasmid pNTS2K-ARS315 was able to grow well in the YPD medium containing 500 μg/mL of G418.After G418 tolerance detection,36a (pNTS2K-ARS315) still could grow well in YPD medium containing 1 mg/mL of G418.Furthermore,the expression of the fluorescent protein by the plasmid pNTS2K-ARS 315 was higher than that by the ordinary commercial plasmid.It can be concluded that all of the four ARSs functioned and the ARS315 had the highest replicate ability in S.cerevisiae.Consequently,ARS315 can be potentially used for high expression and stable recombinant strain construction and metabolic engineering of S.cerevisiae.

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2017(043)003

【总页数】6页(P20-25)

【关键词】酿酒酵母;自动复制区;高拷贝复制整合型质粒;荧光蛋白

【作者】沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权

【作者单位】江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技

术实验室,新加坡;江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122

【正文语种】中文

在酵母表达蛋白以及其他有机产物的过程中，通过增强转化过程中的酶活性来加快产物生成是研究者公认的观点，而高表达特异性酶是解决问题的主要途径。寻找1个新颖匹配的启动子或构建1个高效表达系统是非常困难且需要大量的时间。向

宿主细胞中引入大量目的基因是最先广泛采用的方法。在酵母表达过程中，传统的表达载体YEP，YCP和YIP常常被用来引入外源基因。但是，YCP和YIP存在低

拷贝的缺点，而YEP表达不稳定[1]。高拷贝数地将目的基因整合入酵母基因组是

高表达且稳定的必要途径。酵母自动复制区作为酵母染色体复制起点，在染色体复制过程中起着至关重要的作用[2-3]。如果这些位点发生突变会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能[4]。其活性还可能与其他诸如ARS侧翼序列特征，染色体定位，染色体修饰等因素有关。每条染色体复制都是在间隔40～100 kb的多个位点起始的，每个起点在1个细胞周期的中期S期相继被激活，起始1次染色

体复制[5-7]。在酵母基因组中，存在着300多个自动复制区，而找到高效的自动复制区是构建高拷贝质粒的前提。本实验在酿酒酵母整合载体pNTS2K中的Nde I和EcoR I之间(见图1)分别引入4种ARS，筛选出高效的复制区ARS315，从而构建了一种高效的复制整合型载体pNTS2K-ARS315。通过质粒pNTS2K-

ARS315表达荧光蛋白，其表达效果高于普通商业质粒。因此，这种质粒可以在

G418抗性基因KanMX两侧，2个rDNA片段之间(见图1)引入多个表达框。随

着G418抗性的选择压力，尽可能多的将外源基因表达框整合在酵母基因组多拷

贝rDNA区域，为以后外源基因的高效稳定表达奠定了基础。

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌种

酿酒酵母整合载体pNTS2K由本实验室构建，以pUC19为骨架，引入rDNA 整

合区片段及KanMX表达框，如图1所示。大肠杆菌(E. coli)DH5α，酿酒酵母(S. cerevisiae)Juk36a (URA3缺陷型)由本实验室保存。

1.1.2 酶和试剂

酵母基因组提取试剂盒、DNA聚合酶以及Phusion高保真酶购买于Thermo Scientific 公司；限制性内切酶和T4连接酶购买于NEB公司；LB培养基、YPD

培养基、氨苄青霉素(Amp)以及G418购买于Sigma公司，引物也由Sigma 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建

用酵母基因组提取试剂盒提取Juk36a基因组DNA。由于ARS活性可能与诸如ARS侧翼序列特征、染色体定位和染色体修饰等因素有关[8]，所以根据NCBI上

S288c基因组序列，针对各ARS序列上下游200 bp处设计4对特异性引物(见表1)分别扩增ARS304、ARS315、ARS735和ARS1512片段，并在上下游引物5’末端引入Nde I和EcoR I酶切位点。PCR扩增条件为98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s,

60 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min, 循环30次；72 ℃ 2 mins；4 ℃保存。用1%琼脂糖凝

胶电泳鉴定PCR产物，用胶回收试剂盒回收特异性条带。用限制性内切酶Nde I

和EcoR I双酶切胶回收产物和pNTS2K质粒。纯化酶切反应液后，用T4连接酶

连接，转化DH5α感受态细胞。经菌落PCR鉴定后，挑取阳性转化子37 ℃过夜

培养。然后提取质粒，并用Nde I和EcoR I酶切鉴定。

1.2.2 酵母转化

将所得到的正确质粒pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS 735

和 pNTS2K-ARS1512(如表2所示)用Nanodrop检测浓度后，分别稀释到100

ng/μL。按照Gene Pulser XcellTM Electroporation System 标准方法，分别将5 μL质粒加入到40 μL酵母感受态细胞中进行电转[9]，然后分别涂布于含有300 μg/mL G418的YPD平板上，培养3天后挑取转化子。转化率=转化子数/质粒DNA质量。

1.2.3 转化子的复筛及比较

最终OD600 nm的测量是衡量细菌产量的标准，也是细菌生长率的体现，是外源基因高表达的必要前提[10]。因此，从生长出的不同转化子中(如表3所示)分别挑出5个最大的单克隆于2 mL YPD培养基中培养过夜，以OD600nm 为0.05转接到5 mL含有500 μg/mL G418的YPD培养基中培养48 h，测OD600nm吸光值。

1.2.4 复制能力的比较及检测

将生长能力最强的Juk36a(pNTS2K-ARS315)菌株分别接种于含有不同梯度的

G418的YPD培养基的24孔培养板中，每孔培养体积为0.6 mL，放入Infinite F200PRO (TECAN)中监测40 h得到生长曲线。

1.2.5 质粒的应用及检测

将得到的复制能力最强的质粒pNTS2K-ARS315为骨架，以本实验室普通商业酵母表达载体pPY1(以2micron 为复制区，由本实验室保存)作为对照，分别引入荧光蛋白表达框。经过酶切、连接，转化到DH5α感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后，挑取阳性转化子37℃过夜培养，提取重组质粒pNTS2K-ARS315-EGFP和pPY1-EGFP(如表2所示)。然后将得到的质粒转化到酿酒酵母Juk36a(URA3缺陷型)中，检测转化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)和36a(pPY1-EGFP)(如表3所示)的荧光强度。

2.1 ARS片段的获得及质粒的构建

以酿酒酵母Juk36a基因组为模板扩增ARS304(930 bp)，ARS315(584 bp)，

ARS735(844 bp)和ARS1512(1042 bp)4条序列，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检

测PCR产物结果如图2所示。从图2中可以看出，目的条带单一，大小与预期结果一致。

将PCR产物回收后，分别用Nde I和EcoR I双酶切，然后连接到整合载体

pNTS2K上，转化到大肠杆菌DH5α中，进行大肠杆菌菌落PCR鉴定，挑取鉴定后的阳性克隆培养，提取质粒，Nde I和EcoR I双酶切鉴定结果如图3所示。

从图3中可以看出，各重组质粒经双酶切得到2条带，对照质粒pNTS2K得到1

条带，且大小都与预期相符.同时，将所得阳性质粒送往公司测后，NCBI比对与

S288C酿酒酵母相关ARS序列一致。

2.2 酵母转化子的获得

在相同条件下，由于单细胞内质粒拷贝数的多少直接影响细胞抗性能力的强弱，所以酵母转化效率以及转化子单克隆大小是鉴定ARS自主复制活性强弱的直接指标。本实验以整合质粒pNTS2K为阳性对照，将构建好的含ARS复制区的复制整合型质粒pNTS2K-304、pNTS2K-315、pNTS2K-735和pNTS2K-1512电转化酿酒酵母Juk36a后，在YPD平板上筛选耐G418的转化子。根据酵母转化率以及克

隆大小初步评估4种复制区自主复制能力，结果见图4。从图4中可以看出，4种重组质粒转化酵母后都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上产生大量的转化子，且克隆明显多且大于对照组。还可以看出，转化子36a(pNTS2K-ARS315)和36a(pNTS2K-ARS1512)克隆大小较其他2组要大。上述结果说明这4条ARS都具有独立自主复制能力，且ARS315和ARS1512复制能力可能较强。经统计分析，各种重组质粒转化率如图5所示。从图5中可以看出，4种重组质粒的转化率(转

化子数/ng DNA)分别为63,57,41和32，明显高于对照组。对照组pNTS2K的复制依赖于其整合到染色体DNA上，转化率低(5个转化子/ng DNA)。这也初步说明了4条ARS都具有独立自主复制能力。转化率只是代表质粒是否存在于细胞中，

可初步地判断质粒在细胞中的稳定性，而单克隆的大小及抗性的强弱则代表拷贝数的多少及稳定性。所以，虽然质粒pNTS2K-315 的转化率略低于pNTS2K-304，但转化子单克隆明显较大，这说明质粒pNTS2K-315以更多的拷贝存在于单细胞中，表达特异性蛋白更多，对G418耐受性更强。这进一步说明了ARS315复制

能力可能会更强。

2.3 四种转化子抗性生长比较

为了进一步筛选出复制能力最强的ARS，从所得到的转化子中各挑取5个最大的

单克隆于2 mL YPD 培养基中培养过夜，以OD600nm 为0.05转接到含有500

μg/mLG418的5 mL YPD培养基中培养48 h后，分别测OD600nm处的吸光值，结果如图6所示。含pNTS2K-ARS315重组质粒的转化子生长OD最高，平均为8.55；对照组pNTS2K质粒的转化子生长OD最低，平均为0.57。这也进一步说明了4条ARS都具有独立自主复制能力，其中ARS315复制能力最强。

2.4 ARS315复制能力的检测

为了检测ARS315的独立自主复制能力，将转化子36a(pNTS2K-ARS315)接种于含不同梯度的G418的YPD培养基中，在Infinite F200PRO中监测生长曲线，结果如图7所示。从图7可以看出，36a(pNTS2K-ARS315)在含1 mg/mL G418

以下浓度的YPD中均能很好地生长，在含1 mg/mL G418以上浓度的YPD中生长明显受到抑制。这说明pNTS2K-ARS315能够在酿酒酵母中高表达且能抵御1 mg/mL 高浓度G418的毒性，进一步说明了pNTS2K-ARS315有很强的复制能

力且以高拷贝的形式存在于酵母细胞中。

2.5 复制整合型载体pNTS2K-ARS315表达能力检测

为了检测质粒pNTS2K-ARS315是否能正常表达其它蛋白及其表达能力。将得到

的含荧光蛋白的质粒pNTS2K-ARS315-EGFP和pPY1-EGFP转化酵母后，都能

得到发荧光的转化子36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)和36a(pPY1-EGFP)，如图8

所示。

在荧光显微镜下，以ARS315为复制区的表达载体表达的荧光蛋白的转化子

36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)产生的荧光强度明显较强。此外，使用流式细胞仪

进一步检测两种转化子，结果如图9所示，从图9可以看出，转化子

36a(pNTS2K-ARS315-EGFP)所产生的带荧光的细胞较36a(pPY1-EGFP) 明显多

且强[11]。这说明以高效复制能力的ARS315为复制区的表达载体表达水平更高。为了进一步检查表达水平的稳定性，将带有荧光的转化子分别挑取10个单克隆，接种于YPD培养基中培养48 h，在Infinite F200PRO中检测比荧光强度(FIC)和OD595nm，结果如图10所示。从图10可以看出，转化子36a(pNTS2K-

ARS315-EGFP)在YPD中培养48h后，产生的比荧光强度较36a(pPY1-EGFP)强

3倍。这也进一步证明了pNTS2K-ARS315有很强的复制能力且以高拷贝的形式

稳定存在于酵母细胞中。

在酿酒酵母的每个复制周期中，实际被激活的复制区较少。虽然大多数ARS都能

被复制起始识别复合体(Origin recognition complex, ORC)结合[12]，但其中有

些复制区被激活的频率比其他要高，ARS315能在约90%的细胞循环中启动复制[13]。当这些复制区克隆到载体上时，这些序列也能行使独立自主复制的功能[14]。而来自转座子Tn903的G418抗性基因KanMX应用较为广泛，并能通过提高

G418的浓度筛选出高拷贝的转化子[15]。构建一种既能独立自主复制，又能将外源基因整合到染色体的载体，优点是可以自由调节外源基因在宿主中的拷贝数[16]，从而达到代谢路径通畅且代谢平衡。本实验证实四种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制，其中ARS315复制能力最强，其转化子36a(pNTS2K-ARS315)能在含高达1 mg/mL G418的YPD培养基中正常生长, 而且该质粒能高效表达荧光蛋白。因此，ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒，为酿酒酵母进行基因工程改

造建立了技术平台。

【相关文献】

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文库鉴定方法(酵母文库筛选)-总结

文库鉴定方法 1、质粒的转化 a. 取200μl感受态宿主菌（DH-5α），放置冰上融化； b. 加入1μl质粒，轻轻混匀后置于冰上30min； c. 42℃水浴热休克90sec，迅速放入冰上2min； d. 加入300μl SOC培养基（不含抗生素），置于37℃摇床，转速200rpm，复苏45min； e. 菌液分别稀释100倍，10000倍涂布于15cm培养皿上（Ap r-IPTG/x-gal LB固体培养基），37℃过夜。 2、克隆鉴定： a、挑克隆，37°C，200rpm培养过夜，挑克隆摇菌抽质粒作为PCR模板。 在PCR管中依次加入以下试剂，混匀 Reaction Component per rxn ddH2O19.5 μl 10×PCR Buffer 2.5 μl 50×dNTP Mix 0.5 μl T7SP 0.5μl 3’AD 0.5μl rTag 0.5μl PCR模板1μl Total Volume(μl)25 μl b、轻拍混匀各组分，稍稍离心后放到PCR仪。 c、按下面程序开始PCR： 94℃3min 36 cycles： ●94℃ 30sec ●55℃ 30sec ●72℃1min 72℃5min d、从各管中分别取5ul电泳，检测

次级文库鉴定引物序列： T7 Sequencing Primer 5'–TAATACGACTCACTATAGGGC–3' 3' AD Sequencing Primer 5'–AGATGGTGCACGATGCACAG–3' 引物序列: pGADT7 –F (T7) taatacgactcactatagggcgaGCGCCGCCATG pGADT7-R（ADR）GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT

耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]

毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态

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酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定 沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权 【摘要】在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点.因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键.研究中,从酿酒酵母基因组中扩增 得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体pNTS2K中,得到4种复制整合型载体(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS735、pNTS2 K-ARS1512).经电转化后,4种转化子(36a(pNTS2 K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生长.然而,只有转化子 36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液体培养基里较快生长.经过G418耐受性检测后,36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418 的YPD培养基中很好地生长.此外,通过质粒pNTS2 K-A RS315表达荧光蛋白,其 表达效果高于普通商业质粒.实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主 复制,其中ARS315复制能力最强.因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础.%In the case of yeast expression,low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expression vectors.Therefore,finding a high effective Saccharomyces cerevisiae autonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/integrated plasmid is significantly important.In this study,four different ARSs (ARS304,ARS315,ARS735,and ARS1512) were amplified from Saccharomyces cerevisiae and inserted into integrated

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定 摘要：采用PCR扩增酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ号染色体ARS304序列（S1）及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列（S2），并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中，获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1，说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。 关键词：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；自主复制序列（ARS）；重组质粒；复制起始活性 Construction and Identification of Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisiae ARS304 and Its Flank Sequence Abstract：ARS304 gene（S1）and its flank sequence（S2）of Saccharomyces cerevisiae were cloned by PCR，and then connected into the shuttle vector pRS405. Recombinant plasmids pRS1 and pRS2 were successfully constructed and used for electroporation of S. cerevisiae. Results showed that the electricity transformation rate of pRS2 was higher than that of pRS1，indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304 in S. cerevisiae. Key words：Saccharomyces cerevisiae；autonomously replicating sequence （ARS）；recombinant plasmids；replication origins activity 复制起始的调控涉及细胞周期的调控、基因扩增、肿瘤发生等重大生物学问题，是真核生物基因表达调控的重要内容。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中复制起始依赖的顺式作用元件被称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），典型的ARS有一段11 bp富含A/T的保守序列[5’-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3’]，称为ACS（ARS consensus sequence），这些位点发生突变时会导致ARS失去活性，进而影响到复制起始的功能。在酿酒酵母Ⅲ号染色体上已发现有19个ARS元件，但却存在超过3 800个与ACS 相似的序列，并且其中60%的序列能与ACS的8～10个位点匹配[1]，说明自主复制并不单纯受ACS元件数目、方向以及解旋基序数目所控制，其活性可能还与其他因素有关，诸如ARS侧翼序列特征、核小体定位、染色质修饰等[2]。对酵母的ARS进行研究，了解酵母染色体复制起始机制，有利于进一步在表观遗传学水平上探究真核生物复制机理。本实验构建并鉴定酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒，以期为以酵母为模式生物研究真核基因复制机制提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料

中国本土优良酵母筛选和性能研究实验报告

实验报告 中国本土优良酵母筛选和性能研究 1. 实验目的 酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm，其转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒葡萄本身的品种香外，酵母也应产生良好的果香与酒香；（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完；（3）具有较高的抗SO2能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度；（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感；（5）能在低温或适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。 由此可见，酵母的品质对葡萄酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。葡萄酒酵母的筛选后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等。 通过对本土酵母筛选和性能研究，可以掌握酵母培养基和酵母菌的接种方式，酵母菌的细胞形态及生长繁殖过程，酵母菌筛选方法和步骤，同时掌握其性能研究方式。 2. 实验原理 培养基是微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养物配制而成。其中含水分、碳水化合物、氮化合物、无机盐和生长因子等，这些营养物可提供微生物碳源、能源、氯源等，组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同，或微生物种类不同可配成各种培养基。不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不同微生物对pH值的要求将培养基调到合适的pH值范围。 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 3. 材料和培养基 3.1 材料和仪器

米香型白酒酿造产香酵母的筛选鉴定及其产酯规律研究

米香型白酒酿造产香酵母的筛选鉴定及其产酯规律研究 米香型白酒作为白酒传统四大香型之一,不但具有深厚的文化底蕴,还有巨 大的消费市场,但其不足之处在于香气单薄,后味不足。据研究报道,产香酵母具有独特的产酯规律,可以用传统发酵食品增香,目前已广泛应用于白酒、黄酒、果酒中。 为适应不同香型白酒的风格特点使用的产香酵母也有所不同。目前针对米香型白酒风味改善的产香酵母研究稀缺。 本研究以苹果、葡萄、甜酒酿、酒曲、老面、泡菜为原料,从中分离筛选产香能力强,产香独特,发酵性能好的优质产香酵母。将其应用于米香型白酒酿造,通过主成分分析法综合评价感官指标与风味物质含量,旨在得到对米香型白酒增香效果最好的酵母菌株,并对其进行生长特性及产酯规律分析。 论文主要内容如下:(1)以苹果、葡萄、甜酒酿、酒曲、老面、泡菜为原料,通过嗅闻分析、香气分类、香气强度测定、总酯含量测定、48 h内发酵启动情况,分别筛选得到20株产香酵母。经26S rDNA序列分析,确定20株产香酵母分别为6株葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum);1 株仙人掌有孢汉逊酵母(Hanseniaspora opuntiae);3株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);8株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus);2株克鲁维毕赤氏酵母(Pichia kudriazevii)。 (2)将20株产香酵母以及安琪产香酵母粉分别与纯种根霉曲混合制得新型 产香酒曲,以产酒酒曲为对照,分别对酒曲进行外观分析、试饭试验以及测定酒曲糖化力与发酵力。结果显示酒曲不产孢子,没有酸臭味,结块紧,曲香独特,糖化力均达到800 U以上,但发酵力较弱,酿造白酒过程需与产酒酒曲1:1进行混合酿造。

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）

★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：

酿酒酵母的遗传学和分子生物学

酿酒酵母的遗传学和分子生物学酿酒酵母，即啤酒酵母，是一种用于酿制啤酒、葡萄酒、烈酒 等酒类的微生物。其细胞大小约为 5-10 微米，单细胞体积大约是 压缩奶油的十倍。在酒类的制作过程中，酿酒酵母会通过发酵将 糖类转化成酒精，还能产生引人入胜的风味和气味。因此，酿酒 酵母是和酿造工艺一样重要的组成部分，对于制作高品质的酒类 有着至关重要的作用。 酿酒酵母的遗传学和分子生物学是研究酵母发育、代谢、遗传 变异等方面的学科。在这个领域的研究者们潜心探索着酿酒酵母 的生物学机制，以更好地了解酿酒酵母的种类和特征，并进一步 改良酵母，提升其性能，以生产更加出色的葡萄酒、啤酒及其他 酒精饮品。 酿酒酵母的基因组 酿酒酵母的基因组大小为 12 Mb，共有 16 条染色体。在 1980 年代初期，基因测序技术得到急速的发展，使得研究者们可以通 过快速、高效的方式获得酿酒酵母的整个基因组序列信息。自此，遗传学和分子生物学领域的研究在酿酒酵母上得到了广泛开展。

酿酒酵母分子遗传 酿酒酵母不同于动植物，其细胞有两种状态：有性和无性。酿 酒酵母有两个性别，分别为雄性和雌性，它的有性生殖主要通过 雌雄交配进行，其无性繁殖则通过分裂方式实现。 酿酒酵母的基因体系也与其它真菌不同，首先，虽然酿酒酵母 的基因数并不多，但其负责基因转录的RNA聚合酶数量却有之多。其次，酿酒酵母基因编码中90%以上的编码区宁静3个核苷酸呈 现出非常强的保守性，这就意味着不同的进化压力会引起基因启 动子、基因间区域以及非编码RNA区域的巨大差异。鉴于此，基 因调控和基因结构研究成为分子遗传学的重要部分。 酿酒酵母基因的复制和表达 DNA复制及细胞周期相关基因是其中一个研究的方向。酿酒酵母基于调节因子的复制信号，在复制起始点启动复制，然后发生 双链断裂，而后在起始点就地造成新的复制部分，在复制起始点 分裂后继续对整个基因组进行复制。

酵母菌的筛选方案

第一部分：酵母筛选收集 一．土样中酵母的分离： 1．土壤的采集处理 采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。 2. 土壤中菌种的分离： 称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 二．葡萄果表酵母的分离: 1. 葡萄的采集： 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。 2. 菌种分离步骤： 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制

酵母菌的筛选思路和分离筛选流程

酵母菌的筛选思路和分离筛选流程 引言 酵母菌是一类广泛存在于自然界中的真核微生物，被广泛应用于食品工业、制药业、生物燃料等领域。在酿酒、发酵食品和蛋白质表达等过程中，酵母菌的筛选和分离工作显得尤为重要。本文将介绍酵母菌筛选的思路和分离筛选流程，并探讨其在实践中的应用。 酵母菌筛选思路 酵母菌筛选的目的是从大量的菌株中找到具有特定功能或性状的菌株。在设计酵母菌的筛选思路时，需要根据具体需求明确筛选目标，并合理选择筛选方法。 1. 筛选目标确定 酵母菌的筛选目标可以是多种多样的，常见的包括抗生素抗性、耐高温、高活性酶表达等。筛选目标的明确能够指导后续的筛选方法的选择和优化。 2. 筛选方法的选择 根据筛选目标的不同，可以选择不同的筛选方法。常见的筛选方法包括：负选择筛选、正选择筛选和突变筛选。 •负选择筛选：通过引入负选择剂，如抗生素等，将不具有目标性状的酵母菌菌株杀灭，以保留具有目标性状的菌株。这种筛选方法适用于具有特定性状的酵母菌筛选，如耐药性等。

•正选择筛选：通过引入正选择剂，如特定营养物质等，选出具有特定性状的酵母菌菌株。这种筛选方法适用于希望获取具有特定酶活性、产物产量等性状的菌株。 •突变筛选：通过引入诱变剂，将酵母菌菌株引起突变，然后通过筛选出具有目标性状的菌株。这种筛选方法适用于想通过诱变来获得新的酵母菌变种。 3. 筛选条件的优化 在进行筛选实验时，需要根据具体的筛选方法和筛选目标，对筛选条件进行优化。优化的筛选条件包括菌种的培养基成分、培养温度、培养pH值等。通过优化 筛选条件，可以提高筛选效率和筛选结果的准确性。 酵母菌的分离筛选流程 酵母菌的分离筛选流程是指将混合菌群中的酵母菌分离并进行筛选的一系列操 作步骤。下面是一般酵母菌的分离筛选流程： 1.样品采集：从具有酵母菌存在的环境中采集样品，如发酵液、土壤等。 2.样品预处理：将采集到的样品进行预处理，如稀释、过滤等操作，以 去除杂质。 3.培养基制备：根据需求制备适合酵母菌生长的培养基，如YPD培养 基。 4.无菌操作：将培养基装入无菌培养容器中，在无菌工作台内进行无菌 操作，以避免外界菌株的污染。

葡萄自然发酵过程中酵母的分离鉴定及优良葡萄酒酵母筛选

葡萄自然发酵过程中酵母的分离鉴定及优良葡萄酒酵母筛选 葡萄酒是一种以葡萄为原料经过发酵工艺制成的酒类，其口感和品质与所用酵母菌种密切相关。在葡萄自然发酵过程中，酵母菌会附着在葡萄皮上，并参与发酵过程。本文旨在分离鉴定这些酵母菌，并筛选出优良的葡萄酒酵母。 材料与方法 1. 材料 （1）原料：葡萄（品种为赤霞珠）、酵母粉、发酵桶、过滤器、实验室用显微镜等。 （2）试剂：麦芽汁、琼脂糖、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、孟加拉红、美蓝等。 2. 方法 （1）葡萄皮上酵母菌的分离与纯化 将葡萄皮放入麦芽汁培养基中，于30℃培养3-5天。每天观察并记录菌落形态和数量。将分离得到的菌株进行纯化，直至获得单一菌株。 （2）酵母菌的鉴定 采用形态学和分子生物学方法对酵母菌进行鉴定。形态学方法包括显微镜观察、

革兰氏染色、芽孢染色等；分子生物学方法包括PCR扩增、序列分析等。（3）优良葡萄酒酵母的筛选 将分离纯化得到的酵母菌株分别接种到葡萄汁培养基中，于适宜温度下培养。观察并记录不同菌株的生长情况、产酒精度等指标。筛选出发酵性能优良的菌株。结果与讨论 1. 结果 经过分离鉴定，我们共得到10种不同的酵母菌株。通过形态学和分子生物学方法对这些菌株进行鉴定，确定它们分别属于酿酒酵母属、毕赤酵母属等不同种类。在葡萄酒发酵性能测试中，发现某些菌株具有较高的发酵活性和酒精产量。具体数据如下表所示：

2. 讨论 本研究从葡萄皮上分离得到了10种不同的酵母菌株，并对其进行了鉴定和发酵性能测试。结果表明，这些菌株在葡萄酒发酵中具有不同程度的活性。其中，S3、S7和S10菌株的发酵活性和酒精产量较高，具有作为优良葡萄酒酵母的潜力。后续研究可以进一步探讨这些菌株在不同酿造条件下的表现和遗传特性，为实际生产中的酵母选育提供理论依据。同时，对于筛选出的优良菌株进行基因组学和蛋白质组学方面的研究，有助于深入了解其代谢机制和生物学特性，为葡萄酒品质的提升提供技术支持。

高效酒精酵母菌的选育及鉴定

高效酒精酵母菌的选育及鉴定 李忠英;陈杰山;罗跃中;吴永尧 【摘要】从各种腐败水果、葡萄园里土壤等不同基质中筛选分离得到144株酵母菌，采用耐热、耐酒精处理方法，结合TTC法初筛和复筛试验得到一株酒精发酵 的高产酵母菌株，编号为TJ-18。研究结果表明，该菌糖利用率较高，且发酵力突出，40℃培养72 h，CO2失重为10.4 g，酒精产率最高可达5.9%（体积分数）。对其形态及特征做了常规鉴定实验，根据生理生化试验结果，并对照《TheYeast》对酵母的描述，确定TJ-18为酵母属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。%From all kinds of corruption fruit, in the vineyard to soil and so on the different matrix screening separation have 144 strains of yeast, use heat resistant, resistant to alcohol processing methods, combined with TTC method initial screen and complex screen test got a strain of alcoholic fermentation yield yeast strain. Numbers for TJ-18. The results show that the bacteria sugar utilization rate is higher, And fermenting power is outstanding, 40℃culture 72 h, CO2 weightlessness is 10.4 g, alcohol yield the highest can amount to 5.9%(v/v). The form and characteristics of the conventional do identification experiment, according to the physiological and biochemical test results, and control the TheYeast"on the description of the yeast, determine the TJ-18 for Saccharomyces wine yeast (Saccharomyces cerevisiae). 【期刊名称】《食品研究与开发》 【年(卷),期】2014(000)007

酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响

酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复 制活性的影响 真核生物染色体中存在多个复制起始位点，能够使真核生物巨大的基因组在较短时间内完成复制。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的复制起始位点称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在酿酒酵母的TRPI基因紧密连锁DNA序列中发现，含有ARS的质粒转化酵母后能独立存在于宿主染色体外且能自主复制。此后，Irene等从酿酒酵母Ⅲ号染色体中共发现有19个ARS，约为150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT （A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面却表现出明显的差异，部分活性高的ARS却没有ACS保守序列。说明DNA复制起始功能不仅由ACS保守序列决定，还需核心序列3′和5′侧翼序列的参与。 在酵母遗传工程中，不考虑载体-宿主系统的类型、外源基因产物的性质和工程菌的培养条件等因素，重组质粒的稳定性可以从功能上鉴定复制起始位点的活性。通过DNA重组技术将可能含有ARS的DNA片段构建到缺失复制起始位点的质粒后转入 1/ 7

细胞，如果它有较高的细胞转化率并且表现为遗传不稳定性，就表明该片段在宿主菌中可能有复制起始位点活性。本研究扩增了以ARS305为核心的不同长度侧翼序列，并将其构建到酵母整合 型载体pRS405中，通过电转化法转入酿酒酵母细胞中，测定了不同ARS片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性，为后续以酵母作为模式生物研究真核基因的复制与转录机制提供了参考。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学生物工程与技术研究所基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型载体pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Newlon教授馈赠。 1.1.2 试剂DNA Marker，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Agarose购自Invitrogen公司；PCR引物合成及DNA 测序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成；其他试剂为进口分析纯和生化试剂。 1.1.3 培养基大肠杆菌的培养使用LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母浸提物5 g/L，固体培养基琼脂含量15 2/ 7

赤霞珠葡萄自然发酵过程中的酿酒酵母筛选及其发酵特性

赤霞珠葡萄自然发酵过程中的酿酒酵母筛选及其发酵特性 程仕伟;韩鹏;赵慧;屈慧鸽;于英;沈志毅;李记明 【摘要】In the experiments, indigenous S.cerevisiae strains were screened from naturally fermented Cabernet Sauvignon grape from Yantai by use of rose Bengal medium, and then 9 strains were obtained through the identification of WL medium. All strains underwent fermenting performance and tolerance measurement including alcohol, SO2, citrate and high concentration glucose. Finally, three strains were used to pro-duce Cabernet Sauvignon dry red wine. The results suggested that, strain YCF2 had satisfactory fermenting indexes and some of the indexes were superior to commercial yeast strains. Accordingly, it had potential application values in grape wine-making industry.%采用孟加拉红选择性培养基筛选烟台产区赤霞珠葡萄自然发酵醪液中的酵母菌，并经WL培养基鉴定获得9株酿酒酵母。酿酒酵母经发酵性能和耐受能力（酒精度、SO2、酸、高糖）测定，选育3株酵母用于酿造赤霞珠干红葡萄酒，结果显示，菌株YCF2的发酵指标较好，部分指标优于商品化酿酒酵母，具备工业化发酵应用潜力。 【期刊名称】《酿酒科技》 【年(卷),期】2015(000)003 【总页数】4页(P16-19) 【关键词】微生物;酿酒酵母;发酵特性;本土酵母;葡萄酒酿造;葡萄酒 【作者】程仕伟;韩鹏;赵慧;屈慧鸽;于英;沈志毅;李记明

葡萄自然发酵过程中酵母菌和细菌的筛选、鉴定及系统发育分析

葡萄自然发酵过程中酵母菌和细菌的筛选、鉴定及系统发育分 析 李凤梅;谭婷婷;徐丽;王亚云;于建生;王家林 【摘要】Microbes produced in the process of spontaneous fermentation of grapes has important effects on the appearance and the quality of grape wine. In this study, different culture mediums were used for the separation and the purification of yeasts and bacteria in the samples. Four yeast strains and seven bacteria strains were separated and purified by gradient dilution method and crossed purification. The genomic DNA of yeast and bacterial cells was extracted as the PCR template, and 5.8S rRNA-ITS fragments of yeast and16S rRNA fragments of bacteria was amplified and sequenced respectively for blasting identification and phylogenetic tree construction. The yeasts were identified as Torulaspora delbrueckii and Pichia caribbica. Bacteria were identified as Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Bacillus strato-sphericus, and Bacillus thuringiensis.%葡萄自然发酵过程中产生的微生物对葡萄酒的感官质量具有重要影响。利用不同培养基对样品中的酵母菌、细菌进行分离纯化。利用梯度稀释法、划线纯化总共分离纯化得到酵母菌4株、细菌7株，对分离得到的酵母菌和细菌进行基因组DNA提取获得模板，进行PCR扩增，分别得到酵母菌的5.8S rRNA-ITS片段和细菌的16S rRNA片段，片段测序后进行blast比对鉴定，构建系统发育树。酵母菌经鉴定为Torulaspora delbrueckii、Pichia ca-ribbica，细菌经鉴定为Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus sp.、Bacillus licheniformis、Bacillus stratosphericus、Bacil-lus thuringiensis。

酱醪中产HDMF酵母的分离、筛选及鉴定

酱醪中产HDMF酵母的分离、筛选及鉴定 李蕊;王然;郭艳琼;宋焕禄 【摘要】To get the yeast strains that can produce 4-hydroxy-2, 5-dimethyl-3(2H)-furanone(HDMF) using D-fructose as precursor of the fermentation, the yeasts were screened from soy sauce mash. 511 Yeast strains producing HDMF were separated by dilution method, in which 6 strains, Iiquid4-11, 17, 20, 27, 38, 39 had high ability to yield HDMF from20. 237 07 mg/L to 27. 893 25 mg/L. Strains of Iiquid4-11, 17, 27, 38, 39 were indentified as Candida versatilis, and Iiquid4-2O was Zygosaccharomyces pseudorouxii by 26S rDNA D1/D2 area sequential analysis and phylogenetic analysis.%以酱醪作为分离源,筛选可以利用D-果糖作为发酵前提 物的,能产生4-羟基-2,5-二甲基-3[2H]-呋喃酮(HDMF)的高产酵母菌株.采用稀释 法及多种培养基,共分离得到511株酵母菌,其中有6株高产菌株,为liquid 4-11、17、20、27、38、39,产量为20.24～27.90 mg/L.采用分子生物学鉴定方法,经 26S rDNA D1/D2区序列分析及系统发育分析,初步将liquid 4-11、17、27、38、39鉴定为Candida versatilis,liquid 4 20鉴定为Zygosaccharom yces pseudorouxii. 【期刊名称】《食品与机械》 【年(卷),期】2011(027)005 【总页数】4页(P11-14) 【关键词】酵母菌;发酵;HDMF

国内生物分子学技术应用于酿酒酵母的研究进展

国内生物分子学技术应用于酿酒酵母的研究进展 杨国华;马光喜 【摘要】Saccharomy ces cerevisiae is widely used in human society, such as the production of bread, steamed bun, and alcohol beverages. Saccharomyces cerevisiae also plays an important role in the production of fuel ethanol as a renewable resource. Developing rapidly in recent years, molecular biology and genetic engineering technologies have been widely applied to the research on microorganisms. PCR techniques, genetic recombination, protoplast technology, etc. have contributed to the progress in the screening and identification of microbes, the adjustment of metabolite production, and the construction of genetically engineered bacteria. In this paper, we elaborated domestic research progress in recent years in the application of molecular biology technology to the improvement of Saccharomyces cerevisiae.%酿酒酵母的运用已广泛存在于人类社会的方方面面。相比于将其作为面包、馒头、酒类产品的发酵菌株，现今的酿酒酵母更是人类用以开发可再生资源而得到燃料乙醇的重要手段。分子生物学与遗传工程技术作为近代迅速发展起来的新兴学科，已大量应用于微生物的研究，如PCR技术、基因重组、原生质体技术等等，在微生物的鉴定筛选、调节产物的生产、基因工程菌的构建等方面发挥了推动作用。以酿酒酵母为参考对象，阐述了国内近年来运用分子生物学技术改造酿酒酵母的研究报道。 【期刊名称】《酿酒科技》 【年(卷),期】2014(000)011