毕赤酵母常用表达载体

毕赤酵母常用培养基与载体

一、毕赤酵母表达常用载体：

典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。

毕赤酵母表达知识归纳

毕赤酵母表达知识归纳1 a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案： 1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶； 2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了； 3、水浴加热，温度不能高于50度。 D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。 在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。 b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题） 1、制感受态细胞，OD多少比较好？ pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。 说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低 2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。 Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride. 3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。 过滤灭菌的怎么操作？ 我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。 4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。 该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！ 5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。 都是从园里看到的！ 电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400） 6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？ 如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？ 网友的回答： ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。 glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。 想请教下关于菌种保存的方法。 我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有

pPICZαA质粒图谱

pPICZaa载体基本信息 出品公司: Invitrogen pPICZalpha A, pPICZαA, pPICZalphaA, pPICZαA, pPICZaA, 载体名称: pPICZa-A 质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: AOX1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 3593 bp 5' 测序引物及序列: 5′AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ 3' 测序引物及序列: 3′AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ 载体标签: C-Myc, C-His 载体抗性: Zeocin 博来霉素 筛选标记: HIS4 备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。 产品目录号: V195-20 稳定性: 稳定Stable 组成型: 组成型Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pPICZaa载体质粒图谱和多克隆位点信息

pPICZaa载体简介

pPICZαA，B和C是3.6 kb的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个N-端多肽，编码酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α-因子分泌信号。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。 pPICZαA，B和C系列载体包含以下元素： ?5'端含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz 等人，1989;tschopp等人，1987A）。 ?α-因子分泌信号能够分泌性表达目的蛋白。 ?Zeocin抗性基因在大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; Drocourt等人，1990）。 ?C-端含Myc和His标签，可以用于检测和纯化重组蛋白。 ?pPICZ A, B, C三种读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。pPICZaa载体序列

毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％

巴斯德毕赤酵母

巴斯德毕赤酵母表达系统 点击认领 巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。 编辑摘要 巴斯德毕赤酵母表达系统 - 简介 十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。 巴斯德毕赤酵母表达系统 - 毕赤酵母表达系统的特点 自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细

毕赤酵母表达蛋白步骤

毕赤酵母表达蛋白步骤 一、引言 毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。 二、构建表达载体 毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。 三、转化毕赤酵母 将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。转化方法包括电击转化、化学转化等。其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。 四、表达蛋白 经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。接

下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。 五、蛋白纯化 在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。 六、蛋白鉴定和功能分析 蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。 七、应用和展望 毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。未来，可以进一步改进表达载体和培养条件，提高毕赤酵母表达系统的表达水平和稳定性，以满足更多领域的需求。 八、结论

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统 前言： 所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。 抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。 毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。 培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。 贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面 1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长； 2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度 2 天； 3 细胞在 4 度可放几周 几月或几年，存于－80度 1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养； 2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终 OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。 注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养 以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。 以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。 载体pPIC9K酶切为点 线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其 中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。 单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1 或his4 而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位点，见p29-30 以替换位点。 1 如果克隆进Ppic3.5k，线性化时，插入AOX1 用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)；插入HIS4 用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts) 2 如果克隆进pAO815，线性化时，插入HIS4 用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts） 注意如果用pAO815载体，插入2 个或更多拷贝子会产生SacI酶切位点 3 如果克隆进Ppic9k，线性化时，插入AOX1 用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)，插入HIS 4 用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)。 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 1．1 各种母液的配制 10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基)4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。 500*B(0.02%生物素Biotin)4℃保存。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。 100*H(0.4%Histidine组氨酸)4℃保存。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。 10*D(20%Dextrose葡萄糖) 200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。

毕赤酵母表达手册(详细)

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 三叶虫(2007-4-25 13:59:55) 点击:75 回复:0 IP:60.216.104.* 制作者：陈苗商汉桥 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译 后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。 例如：HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3 等基因 在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧 化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性 蛋白的30%以上。AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白 的目的基因的表达。AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因 的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。 表达： AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1 基因。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含 葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1 基因达 到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1 基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts 的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果 细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。

比赤酵母表达载体

1.1.2毕赤酵母表达 载体名称启动子选择标记载体表达方式 胞内表达pPICZ A,B,C AOX1 Zeocin pPIC6 A,B,C AOX1 Blasticidin pGAPZ A,B,C GAP Zeocin pPIC3.5K AOX1 His4、Kanmycin、Ampicillin pAO815 AOX1 His4、Ampicillin pFLD FLD Zeocin、Ampicillin 分泌表达pPICZα A,B,C AOX1 Zeocin pPIC6α A,B,C AOX1 Blasticidin pGAPZαA,B,C GAP Zeocin pPIC9K AOX1 His4、Kanmycin、Ampicillin pFLDα FLD Zeocin 、Ampicillin 表1.2 Invitrogen公司开发的常见表达载体 Table 1.2 Pichia pastoris expression vectors provided by Invitrogen. 毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基 因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。目前所采用的表达载体均为穿 梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主酵母细胞。常 用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体（表1.2），主要是由启动子、终止 子、外源基因克隆位点、选择标记、报告基因和复制起点等元件构成，分泌型载体 还需要信号肽序列，如pPICZα、pPIC6α 和pPIC9K 的α-factor序列。胞内表达适 宜于不含二硫键的非糖基化蛋白，其表达水平较胞外高，但产物纯化较为复杂。而 需要翻译后修饰的蛋白，如抗体、细胞因子等一般选择胞外分泌表达。蛋白被直接 分泌到培养基中，而且酵母自身分泌的蛋白很少，更利于下游工作，也有助于形成 糖基化的有活性天然构象[32, 90]。 His4组氨酸脱氢酶位点

毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子 1.1 毕赤酵母表达系统简介 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。 随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件 由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5′端和启动子的3′端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。目前所采用的表达体均为穿梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主母细胞。 常用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体如下表： 表1 常用表达载体及其选择标记 表达方式载体名称启动子选择标记 胞内表达pPICZA,B,C AOX1 Zeocin pPIC6A,B,C AOX1 blasticidin PGAPZA,B,C GAP Zeocin

毕赤酵母的培养基1

毕赤酵母的培养 巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。 比赤酵母表达常用的培养基： 1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养 制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素） 宿主细胞His- -----------诱变造成的。 MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕 赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。 MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。 2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%

PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周. 3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。 4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。 5 BMMY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB 1.34% 生物素（4×10 -5 ）% 甘油1% 甲醇3%， 毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotin过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。 6 YPDS + Zeocin 培养基酵母粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖2%，山梨醇1M, 琼脂2%，博来霉素100mg/ml 不管是液体YPDS 培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效 1-2周。 7 MGY培养基34%YNB,1%甘油，4×10 -5 %生物素，将800ml

酵母表达系统步骤

毕赤酵母表达系统步骤 （参考Invitrogen公司说明书）： 一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存 1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2挑取转化子，甘油保存。 二、载体构建 1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。 2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3载体测序 测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、线性化DNA 1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶2μl 四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱； 五、感受态细胞的制备 实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯； 1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d； 250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5； 41500g，4℃离心5min收集菌体； 540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀； 61500g，4℃,5min； 730ml无菌水重悬； 81500g，4℃,5min； 910ml 1M 山梨醇重悬； 101500g，4℃,5min； 11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)； 六、电击转化 15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用 毕赤酵母表达系统是一种常用的外源蛋白表达系统，其具有高效、可控和经济等优点，在生物医学工程、生物制药、农业等领域得到广泛应用。 毕赤酵母是一种单细胞真菌，生长速度快、菌丝短并易于培养，因而成为研究常见的微生物表达系统。在毕赤酵母表达系统中，外源基因可以通过插入到毕赤酵母基因组的某一片段中进行表达。毕赤酵母细胞可以在高温的条件下生长发酵，且能够耐受高浓度的乙醇和毒性化合物。这种特性使得毕赤酵母表达系统成为一种十分理想的表达载体。 毕赤酵母表达系统通过上调表达蛋白的信号序列来实现外源蛋白的表达。通常采用的信号序列包括酵母酸性磷酸酯酶2（PHO2）和热休克蛋白83（HSP83）等。这些信号序列会调 节诱导剂的响应，从而促进目标蛋白的表达。 毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的应用非常广泛。一些生物医药领域的蛋白质结构和功能的研究需要大量高纯度的蛋白质样品。毕赤酵母表达系统可以有效快速地表达蛋白质，并保证蛋白质在三级结构和生物活性上的稳定性。这为大量蛋白质的研究和制备提供了便利。 毕赤酵母表达系统还应用于生物工程和农业中。在生物工程领域，毕赤酵母表达系统可以表达固定的基因组或片段，并利用其高效的蛋白质表达能力，制备出一系列催化剂或其他生物活性物质，从而为纳米技术、催化化学、新材料等领域的相关应

用提供支持。在农业领域，毕赤酵母表达系统也可以表达外源蛋白质，发展出一系列新型生物农药，并在植物转基因领域发挥一定作用。 总之，毕赤酵母表达系统具有高效、可控和经济等优点，在生物医学工程、生物制药、农业等领域得到广泛应用，为各行各业的发展提供了有力支持和促进。

毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍

毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍 由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。为方 便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。 表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。 携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达.

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达 孙勇,彭曦,张勇,吕尚军,汪仕良(第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆400038) 提要:目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础。方法通过PCR获得 hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重 组载体pGAPZαA-hITF。BspHⅠ线性化 后氯化锂转化进入X-33, Zeocin筛选转化酵母菌, PCR鉴定目的基因。阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做 Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测。结果经测序及PCR证实, hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同 源重组整合进入酵母基因组中。Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约 为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF 奠定了基础。 关键词:人肠三叶因子;毕赤巴斯德酵母;分泌表达 中图法分类号:R379;R394-33;R394. 3文献标识码:A Construction of hITF yeast expression vector and secreted expression of hITF inPichia pastoris SUN Yong,PENG Xi,ZHANGYong,LU Shang-jun,WANG Shi- liang(StateKeyLaboratory ofTrauma,Burns and CombinedInjury,Institute ofBurns,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective To constructPichia pastorissecreted expression vector of hITF,express recombinanthITF and underlie the base of function analyses.Methods The hITF gene encodingmature peptidewasamplified by polymerase chain reaction,and then inserted into the downstream of the alpha-mating factor signalof theP. pastorisexpression vector pGAPZαA. Recombinantplasmid pGAPZαA-hITF was linearized byBspHⅠand transform ed into theP. pastorisstrainX- 33with lithium chloride. Zeocin resistantcloneswere chosen byYPD plates containing 100μg/ml Zeocin and the presence of insertwas identified using PCR. The positivetransformantswere fermented in flask and the proteins in the culture supernatantwere deposited with TCA andassayedwithTricine SDS-PAGE andWestern blotting.Results Itwas proved that the fragmentamplifiedwasinserted into theP. pastorisexpression vector pGAPZαA correctly by PCR and gene sequencing. After lithiumchloride transformation,the recombinantplasmidwas integrated into the regionsofhomologywithin the yeastgenome. Tricine SDS-PAGE analysis proved that the molecularweight of hITF was about10×103andWesternblotting demonstrated that the expression proteinshave good antigenicity and

pPIC9K序列

载体根本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pPIC9K, pPIC 9K 质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: AOX1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 9276 bp 5' 测序引物与序列: 5´AOX1:5´-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3´；alpha-Factor-F: 5´-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3´ 3' 测序引物与序列: 3´AOX1:5´-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3´载体标签: N-alpha factor 载体抗性: 氨苄和卡那 筛选标记: HIS4 备注: 利用alpha分泌因子，分泌表达蛋白。 产品目录号: V175-20 稳定性: 稳定Stable 组成型: 组成型Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒

载体质粒图谱和多克隆位点信息

载体简介 pPIC9K载体中存在卡那抗性基因，允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝，载体其余局部与pPIC9载体完全一样。pPIC9K载体能够使用的毕赤酵母宿主菌是KM71和GS115。pPIC9K载体详细信息如下：•pPIC9载体大小9276 bp，是融合表达载体。•载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.•利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。•在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。•毕赤酵母中利用HIS4进展筛选。•为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型)•为了将基因插入GS115或KM71的His4