香豆素类荧光探针研究进展
医药化工化 工 设 计 通 讯
Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且
在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合
物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良
好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。
1 二氧化硫衍生物荧光探针
二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的
平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活
细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对
HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香
豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的
线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱
和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。
Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中
Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计
合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。
4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于
实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基
是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语
以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之
一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与
修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础
生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为
“可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。
关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像
中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02
Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes
Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang
Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized.
Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging
香豆素类荧光探针研究进展
邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘
（中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009）
收稿日期：2018–04–10
作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研
究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。
显微镜荧光波长详解
人肉眼对光源波长的颜色感觉红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm
?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420 ?其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2,?Cy3,?Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。 注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。 西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生产商ProteinTech。针对荧光标记二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同类型抗体。 The role of filters in epi-fluorescence microscopy 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
荧光分光光度法测定荧光素钠的含量
荧光分光光度法测定荧光素钠的含量 一、实验目的 1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。 二、实验原理 荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 三、仪器及试剂 1．仪器 960荧光分光光度计； LC-UV 紫外检测器； 微量进样器 2．试剂 ① 二氯荧光素（分析纯）； ② 荧光素钠 四、操作步骤 1.标准溶液配制 准确称取0.05g 二氯荧光素标样，配制成2500ml 溶液，则此溶液浓度为0.05μm/mL ，分别移取此溶液2.0ml 、4.0ml 、6.0ml 、8.0ml ，于25ml 容量瓶中，bc I I F εφ0303.2=Kc I F =
并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。 2.荧光强度测定 (1)荧光光度计操作 开启220V稳压电源至220V； 打开主机电源开关。 检查氙灯电是否开启。 (2)二氯荧光素发光谱的绘制，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm； ⑤激发波长范围200-350 nm； ⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中； ⑦扫描得到激发光谱。 (3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到； ⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm； ⑥将1号标准溶液放入试样池中； ⑦扫描得到荧光光谱。 仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。 五、数据记录及计算 1.列表
荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
荧光探针研究新进展
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
荧光探针汇总
精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH
基于EET机理比率型荧光探针的研究进展
有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.sodocs.net/doc/9211343729.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展 陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036) （b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024) 摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比 率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。 关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。 与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计
显微镜荧光波长详解
?人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex围才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420
其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA 可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量
各类荧光素的发射激发波长
Ｐｒｏｂｅ Ｅｘ（ｎｍ） Ｅｍ（ｎｍ） ＭＷ Ｎｏｔｅｓ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｂｅｓ Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ ３２５ ３８６ ３３１ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ ３５０ ４４５ ３３０ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ ３６０ ４１０ ３１７ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ ３７５；４００ ４２３ ５９６ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ ４２５ ５２８ ＮＢＤ ４６６ ５３９ ２９４ ＮＢＤ－Ｘ Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＰＥ） ４８０；５６５ ５７８ ２４０ ｋ ＰＥ－Ｃｙ５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ４８０；５６５；６５０ ６７０ ａｋａ Ｃｙｃｈｒｏｍｅ， Ｒ６７０， Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ， Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ ＰＥ－Ｃｙ７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ４８０；５６５；７４３ ７６７ ＡＰＣ－Ｃｙ７ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ６５０；７５５ ７６７ ＰｈａｒＲｅｄ Ｒｅｄ ６１３ ４８０；５６５ ６１３ ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ４９５ ５１９ ３８９ ＦＩＴＣ； ｐＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＦｌｕｏｒＸ ４９４ ５２０ ５８７ （ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ） ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ ５０３ ５１２ ＴＲＩＴＣ ５４７ ５７２ ４４４ ＴＲＩＴＣ Ｘ－Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ５７０ ５７６ ５４８ ＸＲＩＴＣ Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ５７０ ５９０ ＰｅｒＣＰ ４９０ ６７５ Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
主要荧光素一览表
（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。
常见荧光素
常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA
生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结
生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，
双光子荧光探针的研究进展
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。