锌离子荧光探针研究进展

检测锌离子的荧光探针

检测锌离子的荧光探针 姓名：徐英学号：51007008 专业：应用化学 摘要：锌是人体必需的微量元素之一，是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质。锌的过量与不足都会导致人体代谢异常，产生疾病，因此，Zn2+含量的测定在临床、医药、食品、环境监测及科研中都有极其重要的意义。本文简要综述了测定细胞内游离锌离子荧光探针物质的化学规律、性质和优缺点。 关键词：Zn2+、荧光探针、定量检测 1、前言 在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第25位，在地壳中的平均含量波动于0.004-0.02%之间。锌是位于元素周期表第II副族的过渡金属元素，具有3d104s2的价电子结构，通常只失去s电子而成+2氧化态。Zn2+的原子半径较小，且因其带两个正电荷，所以它对电子的亲和力很高，是一个强的质子受体[1]。 1940 年Eggleton首先提出人类需要锌[2]。Prasad和Sandstead 等研究明确了锌是人类必需的微量元素[3]。Zn2+是人体内第二富集的过渡金属，广泛分布于人体内部。 据研究表明，锌在许多生理、生化过程中发挥着极为重要的作用，例如:锌离子是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属离子之一；它可作为金属蛋白酶的结构因子或转录因子；可以和许多调控酶相互作用，作为第二信使触发或阻断诸如细胞凋亡等重要生理过程；具有调控大量离子通道的能力，参与神经传导的过程；同时，锌离子在中枢神经系统（CNS）中还扮演着非常重要的角色。新近研究还表明，锌离子的浓度大小与多种疾病的发生紧密相关[4]。 缺锌对机体有重要影响: 一是对生长发育和组织再生的影响；二是对性器官和性功能的影响；三是锌依赖酶(含锌酶)的活性降低；四是缺锌可使胰岛素降解加剧，引起血中胰岛素水平下降及对葡萄糖利用率减少，葡萄糖耐量下降；五是缺锌可引起血液内视黄醇结合蛋白的浓度降低，影响组织对维生素A 的利用，使人的暗适应能力下降，还有对皮肤及味觉等的影响[5]。虽然缺锌给人体带来了极大的伤害，但是人体内锌含量的超标也会造成同样大的伤害，如：补锌过量会使人的免疫力下降；可诱发人体的铜缺乏；过量补锌可降低机体内血液、肾和肝内的铁含量，出现小细胞低色素性贫血，红细胞生存期缩短，肝脏及心脏中超氧化物歧化酶等酶活性下降 (6) 因此，若能实时跟踪、监测生物体中的锌离子，就有可能使人们在细胞层次或者组织层次上进行锌离子的生理、生化行为的研究。这对揭开生物体系中锌离子与生物体内许多重要生理、生化功能之间的关系之谜具有极其重要的科学价值。 自1987年第一个锌离子荧光探针(TsQ)诞生以来，陆续研制开发了几种锌离子荧光探针，如Zinquin，Zinpyr-l，ACF-l，ACF-2，NewportGreen等。人类利用这种方便快捷的方式检测Zn2+，为研究生物体内Zn2+的功能和性质以及它的结合方式，探索锌在生物体中的作用做出了卓越的贡献[7]。但在测定生物活体内的游离Zn2+的浓度方面仍存在一定的困难。 2、荧光离子探针识别机理及影响因素 在锌离子的荧光检测中，最关键的是荧光选择性配体的设计。目前报道的荧光选择性配体的基本结构可分为:荧光发色团—间质—识别基团三部分(如图1所示) [4]，其设计大多基于光致电荷迁移(PCT)和电子迁移(PET)两种荧光机理。也有将两种机理结合起来设计的荧光配体。但无论基于何种机理，荧光配体中的荧光发色团和识别基团的选择均极为重要。

荧光比率探针及其应用研究进展

７ 前　言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用，　此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据，　通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊　，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京　１０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用，　如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－　Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、　ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２

荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

用于锌离子检测和成像的比例探针和近红外分子探针

用于锌离子检测和成像的比例探针和近红外分子探针

摘要：由于Zn2+在生理功能中起着重要作用，生物样品中Zn2+的检测和成像引起了大家极大的兴趣。但是只有分子探针与Zn2+特异结合后引起的发射光谱变化，这一研究才成为可能。与Zn2+结合后，能“开启”发光或者荧光发射光谱移动的分子，是用于体内成像的理想的分子。在这篇文章中，我们特别关注了比例探针和近红外探针。因此，在化学传感器或分子探针领域，设计能在近红外区域比例感应或成像的荧光分子，引起了化学家的关注。这篇重点综述的目的是阐明这一领域的最新发展，并强调了为未来应用而进行进一步研究的重要性。 关键词：化学传感器，荧光探针，分子探针，比例传感器，锌 1. 引言 锌是人体内存在的第二大丰富的过渡金属离子，它在细胞内和细胞外功能中扮演多个角色。已查明大量的蛋白质和酶含有Zn2+。据报道，Zn2+与许多神经紊乱疾病有关，如帕金森病和癫痫病等。此外，锌在胰岛素分泌和凋亡的过程中起着关键的作用。据世界卫生组织估计，非洲和亚洲超过40%的儿童成长过程中的发育不良与饮食中锌的含量过低有关。锌离子缺乏的状况一直延续到今天并在很大范围内扩展，而且难以检测是因为缺乏合理的锌的生化标记物。 除了生长发育，包括免疫、内分泌和胃肠道系统在内的许多的身体机能都受到锌离子的影响。为了广泛的研究生物学中锌的多样化的生理功能，就需要灵敏的和无创的技术来实现实时探测和成像。生物细胞内Zn2+的相对浓度在1nM到1mM范围，在许多细胞的细胞质中只有1nM而在人类大脑中神经元突触囊泡内则达到1mM。虽然细胞中锌的总浓度较高，但不与蛋白质强烈结合的游离锌的浓度极低。因此很难用传统的方法测定的游离锌的浓度。这些问题使化学家优先考虑开发选择性和高效率的锌离子探针，即所谓的锌离子化学传感器最的问题。 由于锌对于大部分的分析技术是不可见的，所以荧光技术是一个很好的选择。这种方法利用能识别Zn2+的探针分子，探针分子与Zn2+结合后发出特定波长的光，于是就可以用荧光显微镜跟踪活细胞内的锌离子。荧光分子探针由荧光团以及与其相连的螯合剂或是带或不带空间基团的离子载体组成。当探针分子与分析物结合后会使荧光强度或波长发生变化，于是就产生了信号输出（Figure 1）。荧光信号传导机理通过荧光的变化过程发生的，如电荷转移，电子转移，能量转移，激发物的形成，或构象的变化。在这些机理中，光诱导电子转移（PET）因为能显著的影响荧光发射光谱而被广泛用于化学传感器的设计。 2. PET：优先选择的信号传导机理 许多荧光传感器是基于PET原理作为信号传导的过程来设计的。由于电子转移，荧光分子在初始状态时不发荧光。金属离子与受体结合后降低了供体向荧光团电子转移的效率，由PET引起的荧光猝灭就较难发生甚至是完全中断。因

荧光探针汇总

1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

荧光探针研究新进展

《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波　徐　洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门　361005) 摘要　自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词　荧光探针　分子信标探针　荧光PCR 1　常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2　分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41

荧光探针汇总

精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位

备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH

基于EET机理比率型荧光探针的研究进展

有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.sodocs.net/doc/f516161231.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展 陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036) （b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024) 摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比 率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。 关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。 与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计

游离锌离子形态学检测方法探究

游离锌离子形态学检测方法探究【摘要】目的:使用ivZnSAMG、ZnSeAMG、iZnSAMG、TSQ荧光、Zinquin荧光对海马苔藓游离锌离子进行染色和比较。方法: ivZnSAMG：采用Na2S溶液灌流的锌离子结合方式；ZnSeAMG：采用事先注射硒酸钠的体内锌离子结合方式；iZnSAMG：采用取动物新鲜组织浸泡在浸染液中的锌离子结合方式；以上三种方法处理后均采用相同的AMG孵育显色。TSQ、Zinquin荧光 :均为新鲜组织取材，液氮处理后荧光下观察。结果：在小鼠海马，所有染色方法均能标记出苔藓纤维的染色，各种染色在苔藓纤维标记有细节上的差异。所有染色方法中特异性最高的是ZnSeAMG；但其敏感性相对较差。而ivZnSAMG的敏感性最高，而其特异性则相对较差。结论：本实验中使用的游离锌离子染色方法都能成功的对游离锌离子进行标记，而这些染色方法的特异性和敏感性各有不同，对染色细节的雕琢能力也各有不同，因此可以根据这些方法的各自特点在实验选取适合的方法。 【关键词】游离锌离子；N(6methoxy8quinolyl) p toluene sulfonamide (TSQ)荧光技术；金属自显影；Zinquin 荧光技术；苔藓纤维 ＡｂｓｔｒａｃｔObjective:To compare the difference dying results of the free zinc in the hippocampus mossy fiber between the different methods such as Na2SAMG、ZnSeAMG、iZnSAMG、TSQ

Fluo-3 AM_钙离子荧光探针_

Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 产品简介： Fluo-3 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。 Fluo-3和Fura-2相比，其优点是：一方面可以被氩离子激光(argon-ion laser)的488nm激发光激发，便于检测；另一方面，Fluo-3和钙离子结合后荧光变化更强，即对钙离子浓度变化的检测更加灵敏；同时，Fluo-3和钙离子的结合能力较弱，这样可以比Fura-2检测到细胞内更高浓度的钙离子水平；此外，对于细胞内的钙离子的即时变化反应得更加准确，减小了因为和钙离子解离速度慢而导致的荧光变化滞后。 本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM。 Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。 Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。Fluo-3的激发光谱和发射光谱参考下图。 用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育15-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。 保存条件： -20℃避光保存，6个月有效。 注意事项： 本Fluo-3 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用本产品的文献： 1. Li H, Wang L, Ye L, Mao Y, Xie X, Xia C, Chen J, Lu Z, Song J. Influence of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing signal molecule N-(3-oxododecanoyl) homoserine lactone on mast cells.

生物化学与分子生物学进展(基础)期末考试总结

生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，

锌离子探针

锌离子荧光探针 第一章 前言 锌离子的重要性 锌是人体中含量仅次于铁的重金属元素，广泛分布于人体细胞和体液中。很多事实表明锌在细胞生物学和细胞营养过程中起着非常重要的作用。例如, Zn2+是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属离子之一, 其中有碳酸酐酶、羧肽酶、碱性磷酸酶、胶原酶等[。另外, 锌在细胞生长、生存中所起到的关键作用已在生物学、生理学和病理学中得到认识, 例如, 蛋白质结构和功能、DNA 和RNA 合成、基因表达和大脑新陈代谢或疾病的产生都与锌密切相关。同时, 锌和钙一样在各种类型的细胞中还是一种信号离子。但是, 生物体中的锌大多以络合形式存在, 分子内和分子间的游离Zn2+的浓度很低。大部分锌离子与酶或蛋白质紧密结合，而游离的锌离子也存在于脑、肠、胰腺和视网膜等人体组织中。近年来, 人们已经了解到Zn2+的几种传输器的结构、功能以及它的传输形式, 但Zn2+ 的吸收、传输、分配及其与蛋白质结合的控制因素还须进一步解释。而进一步了解锌的作用的关键是在一个比较宽的浓度范围内在细胞内和细胞外定量检测锌的流量和水平。由于Zn2+具有稳定的d10电子构型，很多常用的光谱和电化学分析方法，如紫外-可见光谱、电子顺磁共振和循环伏安法等均不适用于锌离子的测定。荧光分子探针检测法不仅简便，而且灵敏度、选择性、时间分辨、实时原位检测方面均有突出优点。因此，应用荧光探针体系在一个比较宽的浓度范围内定量检测和反映Zn2+的流量和水平，对进一步了解Zn2+在生物体系内的作用具有重要意义。因此，构建荧光传感器对Zn2+进行检测已经引起广泛关注。(中文文献) 荧光探针 锌离子荧光探针的机理 PET、ICT 传统的锌离子探针 稀土发光配合物在荧光探针方面的应用 基于稀土离子的荧光探针 基于稀土离子的锌离子荧光探针 一些稀土、过渡金属配位聚合物的研究 本论文的选题目的及意义 稀土离子配位特点： 相对于过渡金属离子具有较大的离子半径和较高的电荷，它们在配位时往往表现为无方向性和配位数高且多变的特点 锌离子配位特点： 我们所设计的配体的特点： 预期结果以及理论研究 结构上：3d4f 性质上：核磁共振成像、稀土发光和作为锌离子探针的应用前景

双光子荧光探针的研究进展

有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。

用于金属离子识别的新型荧光探针的合成及性能研究

用于金属离子识别的新型荧光探针的合成及性能研究 【摘要】：第一章：介绍了荧光分析法检测痕量金属离子的原理,综述了利用荧光分析法检测金属离子的研究进展。第二章：在蒽醌荧光团上修饰乙醇胺分子合成了用于铁离子识别检测的新的荧光探针。实验结果表明,在乙醇/水=4：1,pH7.20的条件下,Fe3+的加入使体系荧光猝灭,荧光强度和Fe3+浓度在4.0×10-5-3.0×10-4mol/L范围内呈线性关系,由此可以实现乙醇-水体系中对Fe3+离子的高选择性检测。检测限为 3.8×10-7mol/L。第三章：以吖啶为荧光团,亚氨基二乙酸为配体,合成了水溶性较好的吖啶荧光探针ATA,利用红外、核磁对其进行了结构表征。在中性的缓冲水溶液中,考察了金属离子对荧光离子体ATA荧光的影响。结果表明,在pH7.4(0.01MHEPES)的条件下,铜离子的加入使体系荧光猝灭,体系的荧光强度和Cu2+浓度在0.8-3μM的范围内呈线性关系(R2=0.9952),检测限为1.24×10-7M。由此可以实现水体系中对Cu2+的定量检测。实验结果表明荧光离子体和铜离子的结合比为1：1,结合常数为3.58×10-5M-1。第四章：以便宜易得的茜素氟蓝AC作为探针,建立了一种在水体系中识别检测铝离子的比色荧光传感检测方法。结果表明,在乙醇/水=4：1,pH4.6的条件下,AC与铝离子形成稳定的络合物,且络合铝离子后溶液发生了颜色的变化并伴随荧光发射峰的红移。从而可作为一种变色荧光探针用于弱酸性的乙醇-水溶液中铝离子的检测。检测限为 5.19×10-77mol/L。精密度为0.32%。实验结果表明AC和铝离子的结合比为1：2,结合常数为

游离锌离子形态学检测方法探究

【摘要】目的:使用ivznsamg、znseamg、iznsamg、tsq荧光、zinquin荧光对海马苔藓游离锌离子进行染色和比较。方法 : ivznsamg：采用na2s溶液灌流的锌离子结合方式；znseamg：采用事先注射硒酸钠的体内锌离子结合方式；iznsamg：采用取动物新鲜组织浸泡在浸染液中的锌离子结合方式；以上三种方法处理后均采用相同的amg孵育显色。tsq、zinquin荧光 :均为新鲜组织取材，液氮处理后荧光下观察。结果：在小鼠海马，所有染色方法均能标记出苔藓纤维的染色，各种染色在苔藓纤维标记有细节上的差异。所有染色方法中特异性最高的是znseamg；但其敏感性相对较差。而ivznsamg的敏感性最高，而其特异性则相对较差。结论：本实验中使用的游离锌离子染色方法都能成功的对游离锌离子进行标记，而这些染色方法的特异性和敏感性各有不同，对染色细节的雕琢能力也各有不同，因此可以根据这些方法的各自特点在实验选取适合的方法。 【关键词】游离锌离子；n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq)荧光技术；金属自显影；zinquin荧光技术；苔藓纤维 ｋｅｙｗｏｒｄｓ free zinc; n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq) fluorescence; amg (autometallography); zinquin fluorescence; mossy fiber 目前，检测锌离子的手段很多，其中检测细胞内外游离锌离子的形态学手段主要有两种，即金属自显影术(autometallography, amg)和；n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq)和zinquin锌荧光探针技术。timm创始了著名的硫化银染色法，该方法是将“物理显影”的知识转而应用到重金属组织化学上。“物理显影”是19世纪由一位摄影家发明的，并由liesegang作为一种组织化学工具应用到组织学中，目的是使在银盐中暴光的组织中的银颗粒放大。自从timm引入了“某些金属硫化物可以通过物理显影被银放大”的观念，许多科学家应用了这一方法，并试图改进这一技术，而且已经发现了新的可以被银放大的金属微晶。在20世纪80年代早期，timm的硫化银法是成功的锌特异性显示法［1］。同时，出现了硒技术，该技术可以在体内含锌神经元终末产生硒化锌和逆向轴突示踪含锌神经元［1-3］。由于人们对银放大过程的逐渐理解，在组织化学领域，'金属自显影术'逐渐替代了'物理显影'这一名词。amg技术也演化出多种类型的2价金属离子追踪技术［4］。但无论amg技术如何演化，其根本原理仍然是使用银颗粒对2价离子化合物进行包裹，并对2价金属离子信号进行放大进而进行观测。本实验采的硫化钠技术、硒技术就是从上述amg方法中演化而来［4］。此前，我们曾应用amg技术报道了锌离子在脉络丛、视网膜、脊髓、小脑等部位的分布情况［5-9］。海马是神经系统内含锌最多的通路之一［4］，因此本实验采用海马做为锌离子染色的材料。 １材料与方法 1.1 实验动物及分组实验动物为cd 1小鼠10只，体重30～35g，雌雄不限，由中国医科大学实验动物部提供。根据五种不同的染色方法将动物分为5组，每组2只，分笼饲养，常规饮食。 1.2 主要试剂和药品 tsq荧光染色试剂(invitrogen);zinquin荧光染色试剂(日本，dojindo caboratories);乳化银(fluka);戊巴比妥钠(sigma);恒冷箱切片机(leica);双目光学显微镜(olympus)。 1.3 实验方法 1.3.1 amg浸染法(iznsamg) 实验动物2只，均用氯化钠肝素溶液〔9ml 0.9%氯化钠 + 1ml 肝素（500iu/ml）〕灌流30s，直接用250ml 3%的戊二醛固定液灌流15min。所有的溶液均用0.5m的索伦森磷酸盐溶液缓冲。迅速取脑组织，并将组织放在快速组织切片机上，切出1～2mm厚的切片，将切片浸入改良timm溶液中，即浸入含0.1%硫化钠和3%戊二醛的0.1m的索伦森磷酸盐缓冲液中，ph为7.4。将染缸置于震荡器上，保持4℃。72h后，将切片用0.1m