硫醇类荧光探针研究进展
课程论文
(科研训练、毕业设计) 题目：硫醇类荧光探针研究进展
姓名：xxxxx
学院：化学化工学院
系：化学
专业：化学
年级：大一
学号：xxxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxxxxxxx
硫醇类荧光探针研究进展
摘要:硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用，定量检测硫醇在生物化学和临床化学中具有重要的意义。荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文引用文献
51篇，按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。
关键词:硫醇，荧光探针，综述
1 引言
硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。小分子硫醇包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、硫辛酸和辅酶A；大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最高的小分子硫醇(1—10 mmol／L)，它存在氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型GSH的氧化还原动态平衡。大量资料显示，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。
2 正文：利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针
1．利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇
利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物。马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH 5～8时几分钟即可完成。Kanaoka等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物，并于1970年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂1。试剂1是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂，缺点是激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。经过对荧光发射团系统的研究后，Machida等又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂2。试剂2的激发和发射波长分别为400和480 nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团。试剂1和2被称为Kanaoka试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点。近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的GSH、Cys等具有重要生物学意义的小分子硫醇。
1995年Langmuir等设计合成了5个以苯并香豆素(naphthopyranone)为母体荧光团的氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针4—8，这些探针与一些小分子硫醇如GSH、Cys等在生理pH条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定。他们将这5个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针3比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大(其中试剂8荧光量子产率变化最大，0．012～0．66)，是比试剂3(0．021—0．13)更为灵敏的探针。
Liang等组设计合成探针5-maleimidyl-2-(in．methylphenyl)benzoxazole(MMPB)，与其它马来酰亚胺类探针相比，由于MMPB—GSH和MMPB—Cys荧光性质的不同，该探针可以实现对GSH和Cys的选择性响应。在激发和发射波长分别为299．2和355．8 nnl时，MMPB可以选择陛
的检测GSH，在含有0．4倍的Cys的情况下对GSH的检出限可达3．23×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中GSH含量的测定；在激发和发射波长分别为305．6和425．6 nln时，MMPB还可选择性的检测Cys。在同时存在0．15倍的GSH的条件下对Cys的检出限可达6．2×10-10mol／L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中Cys的测定，回收率高、重现性好。该探针虽然可以实现对GSH和Cys的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大。该课题组2005年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针9啪J，激发和发射波长分别为401和496 nm。试剂9用于检测Cys线性范围1．0×10-8～6．0×10-7moL／L，检出限5．7×10-9moL／L；检测GSH线性范围6．0×10-9～4．0×10-7 mol／L，检出限5．64×10-9moL／L。试剂9被成功应用于检测人血清和血浆中的GSH，人尿液中的Cys，回收率96．2％一103．0％。试剂9用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35℃时15 min即可反应完全，且与前一个探针MMPB相比波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。
Matsumoto等设计合成了基于PeT(光诱导电子转移)机理的绿色荧光探针
o-maleimideBODIPY(10)，该探针的荧光被供体BODIPY到受体maleimide的激发态光致电子转移过程(d-PeT)强烈猝灭，与硫醇类物质反应后荧光团BODIPY的荧光恢复，荧光增强350倍，反应前后荧光量子产率变化比较大(0．002～0．73)。该探针是目前所见的马来酰亚胺类硫醇荧光探针中除荧光素马来酰亚胺(fluorescein-5-maleimide)外，唯一在可见光区激发和发射的探针，且信噪比远高于fluorescein-5．maleimide(荧光增强倍数仅有十倍，荧光量子产率变化为0．06—0．64)。探针10可以用来清楚定量地标记极低浓度的__牛血清蛋白(牛血清蛋白最低浓度为5 mg／L)。探针lo由于激发和发射波长均处于可见光区，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰，但是仍没有应用到细胞内进行检测。到目前为止，该类探针应用于细胞内成像的还未见报道。氮取代的马来酰亚胺基团对硫醇类物质选择性好、灵敏度高，是适于检测硫醇的活性基团。因此，改善传统荧光团，开发长波长、长寿命以及双光子激发的氮取代的马来酰亚胺类荧光分子探针，使其更适用于生物活体内检测硫醇或标记硫蛋白，
是今后该类探针发展的一个重要方向。
Ahn等采用固相文库合成法合成出一系列的罗丹明类荧光化合物，并从中筛选出可高选择性的与谷胱甘肽响应的荧光探针11。试剂11在生理条件下(pH 7．4 HEPES缓冲液中)与GSH发生亲核加成反应使荧光增强，30 min即可达荧光最高点。荧光最大增强11倍，荧光量子产率由0．033升高到0．28。GSSG无荧光增强现象，包含巯基的其它分析物(例如DDT、巯基乙醇、Cys)有荧光弱增强现象但是不影响测定。探针被成功应用于实时检测活的成肌细胞(3T3 ceUs)中的GSH浓度的变化，通过加入增加细胞内GSH浓度的硫辛酸和减少GSH浓度的NMM，发现荧光强度发生显著变化，证明其探针能够对细胞内mmol／L的GSH产生响应。
2．利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应(ArSN)检测硫醇
Maeda等m1以荧光素为母体荧光团，设计合成了2个荧光素磺酸酯的硫醇荧光探针12和13。2，4-二硝基苯磺酰基(DBS)强吸电子作用将荧光素的荧光猝灭，由于巯基的强亲核作用发生ArS。反应，磺酸酯键断裂，荧光团母体结构恢复，荧光增强。探针与GSH反应在37℃生理条件(HEPES，pH 7．4)下，10 min即达到荧光最大值，探针12和13的反应速率分别为1．7×102和1．4×102 mol／(L·S)，检出限可达pmoL／L。探针虽然在水溶液中存在水解副反应，但对测定影响不大(37℃生理缓冲液中1 h探针12和13分别仅水解0．7％和1．1％)。
Zhang等设计合成了一个在可见区激发的荧光增强型的可选择性检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)的探针14。该探针激发和发射波长分别为465和588 nm，荧光最大增强可达75倍。更为突出的是该探针可用作Cys和Hcy的裸眼探针，加入Cys或Hcy后溶液颜色发生明显变化(由黄绿色变为橘红色)(图1)，其它18种氨基酸无明显颜色变化。探针利用巯基的亲核性，在温和条件下(25℃，y(甲醇)：y(HEPES缓冲液，pH 7．O)=7：3)反应10 min即可完成。由于位阻效应，其它硫醇在此条件下几乎不发生反应。ACCM细胞激光共聚焦成像实验显示探针膜渗透性好，可以显示Cys和Hcy亚细胞分布。更为突出的是该探针可用于双光子荧光成像，可以极大地减小对细胞的光损伤、提高光穿透的深度、降低细胞内本体自发荧光的干扰。
Jiang等利用荧光团NBD—C1设计合成了一个利用磺酰胺检测硫醇的荧光探针15，由于烷基硫醇与苯基硫酚pKa的不同(分别为8．5和6．5)，在中性条件下烷基硫醇几乎不能电离而苯基硫酚能够大部分电离，电离出的巯基负离子的亲核性远大于巯基。因此，该探针在中性条件下可以选择性的检测苯基硫酚，烷基硫醇不干扰。探针15由于分子内电子转移(1eT)使母体荧光团的荧光被猝灭。由于苯基硫酚中性条件下电离出的巯基负离子具有强亲核性，与2，4一二硝基苯发生ArSN。反应使磺酰胺键断裂，ICT受阻荧光恢复。该探针灵敏度高(与苯基硫酚反应可产生50倍的荧光增强)，选择性好(半胱氨酸、谷胱甘肽、烷基硫醇以及其它具有亲核性的胺、氰根等不干扰测定)，条件温和(室温下pH 7．3磷酸盐缓冲溶液中10 min反应基本完成)，是第一个可以选择性的检测苯基硫酚而烷基硫醇不干扰的荧光探针。由于苯基硫酚是一类高毒性的环境污染物，在石油和煤的精炼厂、橡胶和塑料工业中都会产生大量的苯硫酚
污染物，因此能够选择性的检测高毒性的苯基硫酚在环境科学中具有重要意义。
Bouffard等开发了一个红色的荧光增强型的磺酰胺荧光探针16，由于ICT过程探针分子本身的荧光很弱，与硫醇反应后磺酰胺键断裂，吸收光谱红移158 nm，荧光增强120倍。探针成功用于小鼠胚胎纤维原细胞(313 cells)成像，由于探针的发射波长位于近红外区(623 nm)，该探针具有在小动物的活体内成像的潜能。探针缺点在于本体荧光团在水溶液中的荧光量子产率非常低，仅为0．01。该方法通过加入1％人血清蛋白将其荧光量子产率提高到0．24。Shibata等设计合成了一个罗丹明磺酰胺测硫醇的荧光探针17。该探针基于丹明开环闭环结构的变化，探针本身无荧光，与硫醇类物质反应后磺酰胺键断裂，罗丹明110的强荧光结构恢复，荧光增强5800倍。探针17成功用于人乳腺癌细胞(HeLa cells)共聚焦成像，证明该探针膜渗透性好、可以对活细胞内硫醇浓度的变化产生响应。
3．利用巯基与二硫键的氧化还原反应检测硫醇的荧光探针
生物体内存在巯基和二硫键的氧化还原动态平衡，因此可以利用巯基和二硫键的作用来设计检测硫醇的探针。
Pullela等利用荧光共振能量转移原理(FRET)设计合成了可用于细胞成像的检测巯基的
荧光探针DSSA。该探针以荧光素(D，donor)和罗丹明B(A，acceptor)作为荧光供受体对，中间以二硫键连接。由于荧光素的发射光谱和罗丹明的激发光谱的有效重叠，荧光素的荧光被猝灭，与硫醇反应后二硫键断裂，供受体荧光团分离，荧光素的荧光恢复，通过检测荧光素荧光强度的变化来检测硫醇浓度的变化。探针的优点在于还原电势低(E=一0．6 V)，不会引起细胞内的氧化损伤，探针被成功用于斑马鱼胚胎显微成像。
Piggott利用FRET原理设计合成了FSSF(20)，该探针根据荧光素本身发射光谱和吸收光谱的重叠，将两个
荧光素分子作为供受体对，中间1：2-"硫键连接，探针被成功用于检测GSH及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。该探针足够灵敏，用于活细胞中实时检测GSH、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽转移酶的活性是切实可行的。
Pires等基于二硫键设计合成了探针21。探针由于形成内酯的非共轭结构本身无荧光，当与硫醇类物质反应后，硫醇还原二硫键使其断裂，暴露出强亲核性的巯基负离子，巯基负离子进攻邻近的氨基甲酸盐使酰胺键断裂，罗丹明110的强荧光结构恢复。为了证明氨基甲酸盐的稳定性，Pires合成了对照化合物22。实验发现，在试剂22的溶液中加入硫醇没有荧光增强现象产生，通过对照实验证明了与硫醇反应的官能团是s—S键。探针21成功用于HeLa细胞激光共聚焦成像，证明探针21膜渗透性好，可以对细胞内硫醇浓度的变化产生响应。MIT细胞毒性实验显示，细胞内21浓度为80mol／L时，细胞仍可正常生长。
4．利用醛基与氨基和巯基的共同作用检测含巯基的氨基酸和GSH
利用GSH(23)中巯基和氨基共同与邻苯二甲醛(24)作用产生荧光化合物(25)的方法，是目前在食品、环境、医药卫生等方面比较常用的检测GSH的方法。该方法是1966年Cohn和Lyle 建立的H引，其原理是在碱性介质中，GSH具有还原性的巯基和氨基与试剂24反应产生荧光化合物25，荧光激发和发射波长分别为350和420 nm，在0．06—32．5 p。mol／L范围内荧光强度与谷胱甘肽浓度呈线性关系，反应在室温下，pH 8．0进行，反应时间15 min，产生的荧光化合物25在30 min内保持稳定，测定中氧化型谷胱甘肽，含硫氨基酸、肽、嘌呤等其它物质对GSH的测定没有影响。试剂24的缺点在于波长短，不适用于生物体内检测。
在试剂24的基础上又发展了萘．2，3一二甲醛26。试剂26与24相比优势在于激发和发射波长长，分别为472和528 nm。试剂26是HPLC、激光共聚焦、流式细胞计数和毛细管电泳中常
用的检测谷胱甘肽的荧光试剂
Rusin等开发了可选择性检测Cys和Hcy的探针荧光素二醛27，探针与Cys或Hcy反应后荧光猝灭，紫外吸收光谱发生红移(最大可移动25 am)，溶液颜色发生显著变化(1．0×10。3 moL ／L Cys或Hcy，加入1．0×10～mol／L pH 9．5的探针水溶液中，溶液颜色由黄色转为棕黄色，如图2B和图2C所示)。探针可以检测生理浓度范围内Cys或Hcy浓度(2．9×10一～2．5×10。3 tool／L)的变化，胺、氨基酸、其它的硫醇和蛋白质干扰很小。探针为检测血浆中的氨基硫醇提供了一种很好的荧光和紫外可见方法。
Tanaka等设计合成出荧光增强型醛基荧光探针28。该探针可在中性条件下选择性的检测Cys。根据探针浓度的不同，线性范围分别为20—100 p,mol／L和100¨mol／L～5 mmoVL，反应时间为30 rain。其它的氨基酸(包括甲硫氨酸、丝氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸)和GSH 不干扰测定。不足之处是探针的波长位于紫外区(激发和发射分别为250和380nm)。
GSH生物体内含量最高的小分子硫醇，Cys和Hey都是生物体内重要的氨基酸，目前检测含巯基的氨基酸的荧光分子探针还比较有限，因此利用醛基对含巯基氨基酸的选择性，开发长波长的荧光增强型的高灵敏度的可用于活体内检测的荧光探针是非常有意义的。
5．其它机理检测硫醇
Chen等利用32 nnl的金纳米颗粒(GNPs)与尼罗红(NR)的非共价吸附作用设计组装了硫醇
传感器NRGNPs，NRGNPs可利用荧光法和比色法(团聚)选择性的检测硫醇。由于NR与GNPs之间发生了荧光共振能量转移，NR的荧光被GNPs强烈猝灭，NRGNPs的荧光非常的弱。利用巯基与GNPs的强相互作用，将GNPs表面吸附的NR置换出来，NR与GNPs分离，NR的荧光恢复。在pH 4．0时，NRGNPs溶液的荧光强度随硫醇浓度的增加而增强，而胺、酸、乙醇、牛血清蛋白和血色素加入时没有发生荧光增强现象。NRGNPs对半胱胺和同型半胱氨酸氨酸的检出限分别为10．2和10．9 nmol／L，信噪比为3。虽然随pH的上升，方法的灵敏度有些降低，但在pH 4．0～9．0范围内该方法可应用于检测p．mol／L的硫醇。pH 4．0时加入带有负电荷的硫醇(如巯基丙酰甘氨酸)，NRGNPs溶液的颜色不发生改变；而当加人中性硫醇(如巯基甘油)和带有正电荷的硫醇(如巯基乙胺)时，由于团聚，颜色发生显著改变(分别为紫色和淡紫色)(图3)。基于此，NRGNPs可用作裸眼探针检测浓度大于1．0mol／L的各类型的硫醇。
Ros．Lis等设计合成了水溶性的方酸衍生物29和30。该探针在水溶液中640 nm处本身具有强荧光，与硫醇发生反应后荧光猝灭；乙醇、苯酚、胺、不含巯基的氨基酸、以及强亲核试剂氰根都不干扰测定。探针29和30被成功用于检测血浆中氨基硫醇的总量。
模拟谷胱甘肽过氧化物酶类似物Ebselen，将与巯基类物质发生特异性反应的硒氮键引入荧光染料，设计合成了一种以罗丹明6G为母体含有硒氮键的新型荧光探针(Rh-Se)31用于识别巯基类化合物。基于巯基的强亲核作用将硒氮键打断，从而恢复罗丹明6G的强荧光结构。通过测定探针荧光强度的变化，实现了其对含巯基类物质的定量检测。方法的线性范围为3．0×10-9——1．2×10-7mol／L；检出限为1．4 nmol／L。HL-7702人正常肝细胞及HepG2人肝癌细胞内巯基类物质的荧光共聚焦成像实验表明：探针膜穿透性好，可以对两种细胞内巯基类物质的含量差异产生响应(可以明显地看出肝癌细胞内硫醇的含量小于正常肝细胞)，表现出良好的生物适用性。
合成了一种新型的金属配位桥连环糊精32，用于检测血浆中谷胱甘肽的浓度。金属配位桥连环糊精由于受Cu2+的顺磁性及螫合作用的影响，与没有配合cu2+的主体桥连环糊精33相比，荧光强度减弱。而谷胱甘肽也可以与cu“产生配位作用，这种竞争配位作用导致主体桥连口一环糊精的荧光恢复。基于此建立了一种快速、简便的检测符胱甘肽的方法。在室温下，pH 6．0的PBS缓冲条件下，方法的线性范围为0．30～20．0mol／L；检出限为63．8 nmol／L，血浆中主要成分对测定不干扰。应用本法测定人血浆样品中谷胱甘肽的含量，结果令人满意。
Huang等设计合成了一个长波长的硫醇荧光探针34。该探针本身无荧光，在生理温度的pH 7．0Tfis．HCI缓冲溶液中与硫醇发生自发的不可逆的氧化还原反应，产物35在595 nnl处发出强荧光。探针选择性好，生物体内的其它不含巯基的氨基酸和还原性物质与探针不发生反应，在1～100mol／L范围内荧光强度与硫醇浓度呈很好的线性关系。
3.结论
硫醇是生物体内的重要活性物种，其浓度的变化与许多疾病有着直接的联系，实时准确地检测细胞中硫醇的含量，对于研究其在细胞中的功能和疾病的诊断具有重要意义。关于硫醇的荧光探针的研究，近年来发展极为迅速，特别是最近两年研发出了11个性能良好的探针，其中有6个成功用于活细胞成像，但是在含活性氧和其它抗氧化剂的复杂生物体系中实现荧光探针对硫醇的高选择性识别(特别是对某一种硫醇分子的特异性识别)的问题仍需进一步探索。可以预计今后相关研究将会侧重于以下几个方面：(1)目前检测硫醇的探针多为检测硫醇总量，对某一种硫醇分子特异性识别的比较少见，因此设计合成更多可以针对生物体内不同种类硫醇分子分析检测的特异性荧光分子探针是非常必要的；(2)利用荧光探针分析生物样品存在的一个重要问题便是如何消除生物基体背景荧光的干扰；生物基体背景荧光的寿命(一般在1～10 ns)和波长(<500 nnl)较短，故发展长波长及长荧光寿命的硫醇探__针是一个重要的研究方向；(3)用荧光探针分析生物样品存在的另一个重要问题是光损伤，因此设计合成双光子或多光子激发的可用于细胞内硫醇检测的探针也是一个重要的发展方向。总之，在目前研究的基础上，寻找新的荧光染料和识别基团，研究更适合生物应用的高灵敏度、高选择性的探针是今后硫醇类荧光探针发展的主要方向。
4.参考文献
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5.Tang B,Liu F,Xu K H,Tong L L.FEBS Journal,2008,620(1-2)
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
荧光探针研究新进展
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
双光子荧光探针的研究进展
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
分子荧光的机理和荧光探针原理
1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA
谷胱甘肽荧光探针的研究进展
第46卷第7期2018年4月广 州 化 工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石 磊1,2,黄 玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东 广州 510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东 广州 510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东 佛山 528099) 摘 要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测 中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1 加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1 马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,
PCR和定量PCR的引物和探针设计
引物和探针设计 – PCR 和定量PCR 基本原理 引物设计的重要因素 针对特殊应用的其他提示 引物的质量和纯度目录 1247
基本原理 引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。 体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。 对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 在开始引物设计之前，必须弄清以下几点： PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型） PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR) 样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） 可能的问题（例如假基因、SNP) 1
引物设计的重要因素 2 有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。 最流行的软件为Primer 3(https://www.sodocs.net/doc/ff19135770.html,)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。典型的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。 非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。 应避免编码单一序列和重复序列的引物。 引物长度和专一性 引物的GC 含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。 GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。 两种法则都假设退火发生于以下标准条件下： 50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。 “盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。 最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。 计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。 但是，经常需要经验性地估算最佳温度。 所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C 和65°C 之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。 退火温度 Tm = 2 °C ? (A + T) + 4 °C ? (G + C) Tm = 64.9 °C + 41 °C ? (G + C -16.4)(A + T + G + C) Tm = 100.5 °C + 41 °C ? ? 16.6 ? log 10([Na + ]) C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示
香豆素类荧光探针研究进展
医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。
有机荧光探针最新研究进展
有机荧光探针最新研究进展 徐绍彬 （化学化工学院，1081109001） 摘要荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。 关键词BODIPY 荧光探针染料 探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。 荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。 1 BODIPY类 二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。 1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展 设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。
硫醇类荧光探针研究进展
课程论文 (科研训练、毕业设计) 题目：硫醇类荧光探针研究进展 姓名：xxxxx 学院：化学化工学院 系：化学 专业：化学 年级：大一 学号：xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx
硫醇类荧光探针研究进展 摘要:硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用，定量检测硫醇在生物化学和临床化学中具有重要的意义。荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文引用文献 51篇，按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。 关键词:硫醇，荧光探针，综述 1 引言 硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。小分子硫醇包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、硫辛酸和辅酶A；大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最高的小分子硫醇(1—10 mmol／L)，它存在氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型GSH的氧化还原动态平衡。大量资料显示，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。 2 正文：利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针 1．利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇
荧光定量PCR的原理及使用
荧光定量PCR6勺原理及使用 荧光定量PCR 的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR) 是新近出现的一种定量PCR 检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA ，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA 内插染料 某些染料如SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green I可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA 成正比。 SYBR Green I 荧光染料技术原理SYBR Green I 是一种只与DNA 双链结合的荧光染料。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量。SYBR Green 荧光染料法定量PCR 的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green
染料与DNA 双链结合时发出荧光。2、DNA 变性时，SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR 产物。4、聚合完成后，SYBR Green 染料与双链产物结合，定量PCR 系统检测到荧光的净增量加大。 SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'一5' 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合， 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、
EAST装置的磁探针设计
第28卷 第1期 核 聚 变 与 等 离 子 体 物 理 V ol.28, No.1 2 0 0 8年 3 月 Nuclear Fusion and Plasma Physics March 2008 文章编号：0254?6086(2008)01?0073?04 收稿日期：2007?03?07；修订日期：2007?09?06 基金项目：国家自然科学基金资助项目(10405024) 作者简介：奚维斌(1970?)，男，安徽肥东人，博士研究生，研究方向：EAST 电磁测量系统研究和设计。 EAST 装置的磁探针设计 奚维斌，武松涛，沈 飚，万宝年，宋云涛 (中国科学院等离子体物理研究所，合肥 230031) 摘 要：介绍了EAST 装置中磁探针设计中的结构、安装位置、匝面积的标定、幅频响应，并给出了该磁探针的标定误差和Mirnov 线圈幅频响应特征图。两轮EAST 放电试验表明，电磁测量的信号满足装置运行和等离子体控制的需要。 关键词：EAST 装置；磁探针；幅频响应；工程设计 中图分类号：TL65+5 文献标识码：A 1 引言 EAST 是全超导托卡马克核聚变实验装置，它的物理目标[1]是研究并实现稳态的高参数等离子体。为了实现确定的物理目标，电磁测量中磁探针的设计是重要的。在托卡马克中安装在等离子体边界处的磁探针是一种最简单、最重要的提供运行等离子体信息的工具。这些磁探针也提供用于对等离子体的位置、位形和磁流体动力学(MHD)不稳定控制所需要的各种信号。 本文首先介绍磁探针设计的原理；其次详细地叙说EAST 装置中磁探针的结构、安装位置、匝面积标定及幅频响应；最后给出该磁探针的标定误差及幅频响应特征图。 2 磁探针的测量原理 磁探针是安装在等离子体中或边界处的小螺线管线圈，其工作原理是根据电磁感应定律，当线圈所在空间中的磁场发生了变化时，由于穿过线圈横截面的磁通Φ发生变化，在线圈两端将产生一个感应电动势ε： t B S t Φd d d d eff ?=?=ε (1) 式中，B 为磁探针所在空间磁感应强度在线圈轴向的分量；S NS S Δ+=eff ，N 为线圈匝数，S 为线圈 横截面，?S 是引出线和接头所形成的附加的杂散面积。在EAST 装置中设计了两种骨架尺寸相同的磁探针。一种是测量等离子体位置和形状的磁探针叫小探针。小探针测量的信号经过积分器积分，即ε积分就得到小探针几何中心处的磁场B ，磁场方向是线圈的轴线方向。在托卡马克中一般在垂直于等离子体小环方向的截面上安装一组小探针，来反演等离子体的位置和形状。另一种是测量MHD 的不稳定性的磁探针，叫Mirnov 线圈。Mirnov 线圈测量的信号不经过Mirnov 积分器积分。在托卡马克中Mirnov 线圈安装位置和数量都与小探针相同。 满足EAST 装置电磁测量要求的磁探针必须满足如下条件： a. 所有磁探针安装的空间位置精确； b. 所有磁探针有标定精确的匝面积； c. Mirnov 线圈有100kHz 频率响应, 以使探针输出的信号能真实反映磁场的变化。 3 磁探针的设计 3.1 EAST 装置磁探针结构和安装位置 在EAST 装置中，磁探针是安装在真空为1×10?6Pa 、内部部件的烘烤温度为350℃，承受的磁场为3.5T ，等离子体电流为1MA 的真空室内部。磁探针线圈是采用玻璃丝布套管绝缘的裸铜线。玻
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.sodocs.net/doc/ff19135770.html,/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此网站也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word内标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 TaqMan 探针设计的基本原则： a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。